БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2011, том 37, № 6, с. 403-412
УДК 582.261+577.95 АЛЬГОЛОГИЯ
МОРФОЛОГИЯ, РАЗВИТИЕ И СОСТОЯНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ДИАТОМОВОЙ ВОДОРОСЛИ ATTHEYA USSURENSIS STONIK, ORLOVA
ЕТ CRAWFORD, 2006 (BACILLARIOPHYTA) В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ1
© 2011 г. Т. Ю. Орлова1, Н. А. Айздайчер1, И. В. Стоник1, О. Г. Шевченко1, С. И. Погосян2
1 Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН,
Владивосток 690059
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва 119991
е-mail: torlova06@mail.ru
Статья принята к печати 25.05.2011 г.
В лабораторных условиях исследовали развитие морской бентосной диатомовой водоросли Attheya ussurensis (Bacillariophyta), изолированной из Уссурийского залива Японского моря. Установлено, что развитие водоросли в накопительной культуре характеризовалось короткой лаг-фазой или ее отсутствием и высокой скоростью роста в экспоненциальной фазе (около 1.7 делений в сутки). На стадии стационарного роста в культуре формировались покоящиеся клетки. Описаны морфологические и ультраструктурные изменения клеток в период жизненного цикла A. ussurensis по данным световой и электронной микроскопии. Показано, что функциональная активность фотосинтетического аппарата покоящихся клеток водоросли при длительном (до года) хранении культуры в темноте при температуре 4-6°C сохранялась. Установлено, что культура A. ussurensis после 30, 60, 90, 120, 150 и 180 сут хранения в таких условиях восстанавливалась благодаря наличию в жизненном цикле водоросли стадии, представленной покоящимися клетками.
Ключевые слова: Attheya ussurensis, морфология, ультраструктура, покоящиеся клетки, фотосинтетическая активность.
The morphology, development and the state of the photosynthetic apparatus of the diatom Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, 2006 (Bacillariophyta) in long-term culture. T. Yu. Orlova1, N. A. Aizdaicher1, I. V. Stonik1, O. G. Schevchenko1, S. I. Pogosyan2 (1A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059; 2M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow119991)
The development of the marine benthic diatom Attheya ussurensis (Bacillariophyta) isolated from Ussuriisky Bay (Sea of Japan) was examined in laboratory culture. It was found that the development of A. ussurensis was characterized by a short lag-phase or its absence and high growth rates (about 1.7 divisions per day) during the exponential phase. Resting cells were formed during the stationary growth phase. Morphological and ultrastructural changes in the cells of A. ussurensis during its life cycle are described based on light and electron microscopic observations. Resting cells retained their photosynthetic activity when stored in the dark for a long period of time (up to one year) at a temperature of 4-6°C. After 30, 60, 90, 120, 150, and 180 days of storage under such conditions, the culture of A. ussurensis was capable of regeneration due to the presence of the resting cell stage in the life cycle of the alga. (Biologiya Morya, 2011, vol. 37, no. 6, pp. 403-412).
Key words: Attheya ussurensis, morphology, ultrastructure, resting cells, photosynthetic activity.
Диатомовые водоросли рода Attheya West (Bacillariophyta) - морские бентосные, планкто-бентосные или эпифитные организмы, широко распространенные в арктических и умеренных водах (Lewin, Schaefer, 1983; Crawford et al., 1994). Массовое развитие представителей этого рода нередко наблюдается в прибрежных зонах, где они прикрепляются к субстрату, образуя слизистые пленки, а также вызывают "цветение" воды в прибойной зоне (Lewin et al., 1980; Crawford et al., 1994). Морфология водорослей рода Attheya, обна-
руженных в Японском море, описана достаточно подробно (Орлова и др., 2002; Гогорев и др., 2006; Stonik et al., 2006; Стоник и др., 2006), однако особенности биологии и развития в условиях длительного культивирования изучены лишь у Attheya longicornis (Орлова и др., 2002). Сведения о биологии и жизненном цикле видов рода Attheya немногочисленны, но известно, что они не формируют покоящихся спор (Crawford et al., 1994). В связи с этим интересно выяснить, каким образом вид Attheya ussurensis, нередко достигающий массового раз-
1 Работа поддержана РФФИ (грант № 10-04-01438_а), ДВО РАН (№ 09-1-П23-01, 09-1-П15-03), ДВО-РФФИ (№ 09-04-98570-р_восток_а), а так-
же программой Президиума РАН "Биоразнообразие некоторых районов Мирового океана в пространстве и во времени".
вития в прибрежной части зал. Петра Великого (Stonik et al., 2006; Стоник и др., 2006), переживает зимний сезон и благодаря чему весной становится одним из доминирующих видов в своей экологической нише? Целью данной работы являлось изучение особенностей морфологии, развития и состояния фотосинтетического аппарата морской бентосной диатомовой водоросли A. ussurensis в условиях длительного культивирования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Альгологически чистая культура бентосной диатомовой водоросли Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, 2006 (клон AU-01) была выделена из планктонной пробы, отобранной в июне 2001 г. в Уссурийском заливе Японского моря. Для получения исходного материала 100 мл морской воды и 400 мл питательной среды f (Guillard, Ryther, 1962) тщательно перемешивали и разливали в стерильные чашки Петри. Через несколько суток на дне чашек появлялись клетки с лопастными хлоропластами. Для получения клоновой культуры отдельные клетки изолировали стерильной пипеткой, 3 раза промывали в стерильной морской воде и по одной помещали в чашки Петри со свежей питательной средой объемом 5 мл. Через 5 сут содержимое чашки переносили в колбу Эрленмейера емкостью 100 мл с культуральной средой объемом 70 мл. Маточную культуру выращивали при температуре 20 ± 2°C и освещенности 3500 лк. Культуру освещали люминесцентными лампами (ФАР 15 Вт/м2) со свето-темновым периодом 12 ч свет : 12 ч темнота. Через 5-7 сут культуру пересевали.
Для выяснения изменчивости морфологических признаков у A. ussurensis при длительном культивировании клон AU-01 поддерживали в лаборатории в течение 9 лет с помощью регулярных пересевов в стандартных условиях, описанных выше, и в 2010 г. снова исследовали морфологию клеток культуры. В 2010 г. также был проведен эксперимент по изучению восстановления культуры A. ussurensis после длительного хранения в темноте. Для этого колбу Эрленмейера с клональ-ной культурой AU-01, находившейся в стационарной стадии роста, закрывали алюминиевой фольгой и хранили в холодильнике при температуре 4-6°C. На протяжении шести месяцев из этой колбы через 30 сут отбирали 0.5 мл суспензии, которую переносили в свежую питательную среду и экспонировали в стандартных условиях (12 ч свет : 12 ч темнота, температура 20 ± 2°C) от 7 до 22 сут; в культуре ежедневно контролировали появление вегетативных клеток. Восстановленная после хранения в условиях темноты при низкой температуре культура была обозначена как клон AU-01_a (табл. 1).
Морфометрические измерения клеток выполняли на 10-е сут содержания водоросли в культуре. Морфометрические характеристики панциря получены для 15 клеток из каждого клона. Статистический анализ данных (Student's t-tests) был выполнен с использованием программы STATISTICA Version 7.0 for Windows (StatSoft, Tulsa, USA).
Эксперименты по изучению роста A. ussurensis проводили в накопительной культуре. Пробы для подсчета клеток отбирали в течение 15 сут ежедневно после тщательного перемешивания культуры в одно и то же время через 3 ч после окончания темнового периода и фиксировали раствором Утермеля (Федоров, 1979). Скорость роста водоросли во всех экспериментах рассчитывали в начале и в конце экспоненциальной фазы роста по соответствующей формуле (Guillard, Ryther, 1962). Морфологию изучали на фиксированных рас-
твором Утермеля клетках при помощи светового микроскопа (СМ) Olympus BX 41 (Токио, Япония).
Для изучения ультраструктуры A. ussurensis клетки фиксировали в течение 2 ч в 2.5% глутаральдегиде (Sigma-Aldrich, Германия), приготовленном на 0.1 М какодилатном буфере (pH 7.4), с последующей дофиксацией в 2% четырехокиси осмия на том же буфере (1 ч). Материал обезвоживали в 30, 50, 70, 80 и 96% растворе этанола (по 15 мин при каждой концентрации), а затем в смеси этанол-ацетон в соотношении 3 : 1,
1 : 1 и 1 : 3 (по 10 мин). Полученный материал выдерживали в смеси заливочной среды Epon 812, Araldit M, DDSA, DMP 30 (Sigma-Aldrich, Германия) и обезвоженного ацетона в соотношении 3 : 1, 1 : 1 и 1 : 3 по 30, 60 мин и 3 ч соответственно, а затем 12 ч в чистой смоле. Препарат полимеризовали в полипропиленовых капсулах Beem в термостате в течение суток при 30°C и в течение суток при 60°C. Ультратонкие срезы были получены на микротоме Ultracut E (Reichert Jung, Германия) с помощью алмазного ножа. Срезы помещали на бленды, покрытые формваром, и контрастировали 6 мин водным раствором уранил-ацетата и 10 мин водным раствором цитрата свинца. Цитологические исследования препаратов проводили с помощью трансмиссионного микроскопа (ТЭМ) JEOL JEM-100 S (Токио, Япония).
В течение 12 мес. изучали состояние фотосинтетического аппарата (ФА) водоросли при хранении лабораторной культуры в темноте при низкой температуре. Для этого на флу-ориметре "МЕГА-25" (Россия) измеряли параметры флуоресценции хлорофилла (Погосян и др., 2009). После длительного хранения водоросли в темноте определяли интенсивность флуоресценции в условиях открытых (Fo) и закрытых (Fm) реакционных центров фотосистемы 2. Максимальную квантовую эффективность разделения зарядов в фотосистеме 2 фотосинтетического аппарата рассчитывали по формуле: (Fm - Fo)/Fm (Genty et al., 1989). Эта величина соответствует коэффициенту полезного действия фотосинтеза на уровне фотосистемы 2.
Реальную квантовую эффективность разделения зарядов в фотосистеме 2 у водорослей, адаптированных в течение 5 мин к облучению светом постоянной интенсивности, равной 16 Вт/м2, с длиной волны 455 нм, вычисляли по формуле: (F'm - Ft)/F'm. Зна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.