научная статья по теме МОЗГ - ОДИН ИЗ ВАЖНЕЙШИХ ИСТОЧНИКОВ ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОНА В ОБЩЕЙ СИСТЕМЕ ЦИРКУЛЯЦИИ У КРЫС В ПРЕНАТАЛЬНОМ И РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «МОЗГ - ОДИН ИЗ ВАЖНЕЙШИХ ИСТОЧНИКОВ ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОНА В ОБЩЕЙ СИСТЕМЕ ЦИРКУЛЯЦИИ У КРЫС В ПРЕНАТАЛЬНОМ И РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ»

НЕИРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 1, с. 27-33

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.175.823; 611.814.1

МОЗГ - ОДИН ИЗ ВАЖИЕИШИХ источников ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОНА В ОБЩЕИ СИСТЕМЕ ЦИРКУЛЯЦИИ У КРЫС В ПРЕНАТАЛЬНОМ И РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

© 2004 г. А. В. Лаврентьева1, А. Я. Сапронова2, Е. И. Адамская3, В. И. Мельникова2, Е. В. Прошлякова2, В. Н. Бабичев3, М. В. Угршмов1, 2*

1НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН, Москва 2Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва 3Эндокринологический научный центр РАМН, Москва

Работа посвящена проверке гипотезы авторов статьи о том, что в период онтогенеза, предшествующий формированию гемато-энцефалического барьера, гонадотропин-рилизинг гормон (ГРГ) поступает из синтезирующих его нейронов переднего мозга в общую систему циркуляции. С помощью радиоиммунологического анализа показано, что уровень ГРГ в периферической крови до формирования гемато-энцефалического барьера - у плодов и неонатальных крыс - значительно выше, чем после его формирования у взрослых крыс, что является косвенным доказательством гипотезы. Более того, формирование гемато-энцефалического барьера сопровождается значительным увеличением содержания ГРГ в гипоталамусе крыс. Прямым доказательством гипотезы является резкое снижение уровня ГРГ в крови у плодов после разрушения синтезирующих его нейронов переднего мозга путем энцефалэктомии.

Гонадотропин-рилизинг гормон (ГРГ) синтезирующие нейроны мозга являются важнейшим звеном центральной регуляции репродуктивной функции у взрослых животных [1, 2]. ГРГ синтезируется нейронами септо-преоптической области переднего мозга, проецирующими значительную часть своих аксонов в срединное возвышение и сосудистый орган терминальной пластины [3, 4], в области которых отсутствует гемато-энце-фалический барьер и ГРГ может поступать в кровеносные сосуды [5]. Несмотря на то, что еще в 70-е годы прошлого столетия было выдвинуто предположение о возможности поступлении ГРГ в общую систему циркуляции в области сосудистого органа терминальной пластины [6], до сих пор в пользу этого представления не получено экспериментальных доказательств. В срединном возвышении ГРГ выделяется в гипофизарную портальную систему циркуляции, обеспечивающую его поступление к гонадотропоцитам гипофиза [7, 8]. Выделение даже относительного небольшого количества ГРГ в срединном возвышении позволяет создать в портальной крови достаточно высокую концентрацию ГРГ, необходимую для оказания адекватного физиологического влияния на гонадотропоциты. После поступления ГРГ из портальной циркуляции в общую систему циркуляции происходит его многократное разведение

* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д.26, тел. 135-88-42; e-mail: mugrumov@mail.ru

до концентрации, недостаточно высокой для оказания физиологического действия на клетки мишени [9, 10] - гонадотропоциты [11], клетки гранул езы и лютеальные клетки яичников [12], клетки Лейдига семенников, [13], клетки иммуно-компетентных органов и тканей [14, 15].

В онтогенезе у крыс ГРГ впервые обнаруживается иммунологическими методами в целом мозге и гипоталамусе на 12-й день внутриутробного развития [16, 17], в преоптической области на 13-й день [18], в сосудистом органе терминальной пластинки на 18-19-й дни, в срединном возвышении - на 18-20-й дни [6, 19, 20]. С помощью энце-фалэктомии плодов крыс in utero и иммунонейт-рализации ГРГ в крови плодов показано, что этот нейрогормон начинает оказывать стимулирующее влияние на секрецию гонадотропинов клетками гипофиза на 21-й день пренатального периода [21, 22]. По мнению авторов, этот факт является доказательством поступления ГРГ в области срединного возвышения из аксонов в уже сформированную гипофизарную портальную систему циркуляции и далее с кровотоком к гонадотропо-цитам гипофиза.

Данная работа направлена на проверку гипотезы авторов статьи о том, что в отсутствие гемато-энцефалического барьера у крыс в пренатальном и раннем постнатальном периодах ГРГ поступает в общую систему циркуляции во всем переднем мозге - области локализации дифференцирующихся

ГРГ нейронов. С этой целью проведен анализ возрастной динамики содержания ГРГ в периферической крови и ткани переднего мозга крыс с 18-го дня пренатального периода до 36-го дня по-стнатального периода. Для получения прямого доказательства поступления ГРГ из переднего мозга в общую систему циркуляции использована экспериментальная модель разрушения переднего мозга - энцефалэктомия плодов in utero с по-следущим измерением содержания ГРГ в крови в опыте (энцефалэктомия) и в контроле (ложно-оперированные).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на крысах линии Вистар -интактных плодах, неонатальных (3-й день) и по-стнатальных животных (36-й день), включая беременных крыс. Кроме того, использованы энце-фалэктомированные и ложно оперированные in utero плоды и соответствующие оперированные под пентобарбиталовым наркозом (100 мг/кг массы) беременные самки (детали описаны в работе [23]). Беременные самки подвергались лапарото-мии. Мозг плодов полужидкой консистенции отсасывали из черепа с помощью туберкулинового шприца, не извлекая плодов из матки, так как стенка матки полупрозрачна. В результате энце-фалэктомии удалялась большая часть мозга, включающая гипоталамическую область и средний мозг [23].

В случае ложной операции делали укол иглой в ту же область головы плода. В экспериментах использовали 22 интактных и 17 оперированных беременных самок.

Определение уровня ГРГ проводили в целом переднем мозге и в сыворотке крови интактных плодов на 18-й эмбриональный день (Э18) и Э21, а также в гипоталамусе интактных крыс самцов и самок на 3-й день постнатального периода (П3) и П36. Кроме того, оценивали содержание ГРГ в крови плодов на Э21 после их энцефалэктомии или ложной операции на Э18. Забор материала проводили под пентобарбиталовым наркозом. Интактных и оперированных животных всех возрастов, кроме Э18, дифференцировали по полу. Пробы крови объединяли: на Э18 - от шести, а на Э21 - от двух плодов на пробу. В экспериментах использовали 90 плодов на Э18 от 10 беременных самок, 36 плодов на Э21 от 4 беременных самок, 16 животных на П3 от 4 пометов и 17 животных на П36 от 4 пометов. Пробы мозга на Э18 объединяли от двух плодов.

Кровь собирали из сердца гепаринизирован-ным наконечником автоматической пипетки. Сыворотку отделяли центрифугированием крови при 400 g в течение 20 мин. У плодов для радиоиммунологического анализа вырезали передний

мозг от стебля гипофиза (каудально) до обонятельных луковиц включительно (рострально). У постнатальных животных вырезали гипоталамическую область от ростральной границы хиазмы до стебля гипофиза. Выделенные ткани нагревали на водяной бане (100°С, 10 мин) в 10 объемах 0.1 N уксусной кислоты для инактивации эндогенных пептидаз, затем охлаждали до 0°С, гомогенизировали и отделяли супернатант центрифугированием (2000 g, 20 мин). Полученный супернатант и сыворотку крови замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70° до определения ГРГ.

ГРГ определяли радиоиммунологическим методом с использованием двух антител [9, 24]. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой и антигена использовали синтетический ГРГ ("Sigma"). Антисыворотка к ГРГ была получена при иммунизации кроликов коньюгатом ГРГ с бычьим сывороточным альбумином (титр 1 : 1200); минимальная чувствительность метода - 7.8 пг/мл. Радиоиодирование синтетического ГРГ 125I проводили иодогеном ("Serva"). Радиоактивность образцов измеряли на гаммаспектрометре ("Searle", Нидерланды) с эффективностью счета 90%. Коэффициенты вариаций внутри и между опытами составляли соответственно 7 и 15%.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты выражали в виде S ± S.E.M.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Интактные животные. Концентрации ГРГ в крови и в переднем мозге, взятых у плодов без идентификации пола, составляли соответственно 11.02 ± 1.85 пг/мл (рис. 1) и 0.65 ± 0.17 (рис. 2).

С Э18 по Э21 концентрация ГРГ в крови плодов без разделения их по полу не изменилась, хотя отмечена тенденция к незначительному снижению (8.69 ± 0.9). При разделении по полу концентрация ГРГ в крови у самок оказалась примерно на 42% выше, чем у самцов (рис. 1). С Э18 по Э21 концентрация ГРГ в переднем мозге возрастает примерно в 3 раза как у самцов, так и у самок (рис. 2).

В период с Э21 по П3 концентрация ГРГ в крови у самцов и самок не меняется. Тем не менее в указанный период отмечена тенденция к незначительному снижению концентрации ГРГ в крови у самок и повышению у самцов. Это привело к исчезновению полового диморфизма на П3 при отсутствии статистически достоверных различий в концентрации ГРГ по сравнению с Э21 (рис. 1). Концентрация ГРГ в переднем мозге (гипоталамусе) не изменилась по сравнению с Э21 (рис. 2).

ГРГ, пг/мл 14

12 10

8 6 4 2 0

Э18

самцы + самки

Ш

Э21 самцы

П3

самки

П36

беременные самки

Рис. 1. Концентрация ГРГ в сыворотке крови плодов (Э18, Э21), постнатальных животных (П3 и П36) и беременных самок.

* -р < 0.05; ** -р < 0.01.

С П3 по П36 концентрация ГРГ в крови падает до неопределяемой величины как у самцов, так и у самок (рис. 1). В свою очередь концентрация ГРГ в переднем мозге (гипоталамусе) увеличилась почти в 4 раза (рис. 2).

После энцефалэктомии плодов на Э18 к Э21 концентрация ГРГ в крови снизилась вдвое у плодов обоих полов по сравнению с контролем (рис. 3). У энцефалэктомированных и контрольных (лож-нооперированных и неоперированных) плодов не обнаружен половой диморфизм в уровне ГРГ в крови (рис. 3).

У самок на 18-й и 21-й дни беременности концентрация ГРГ в крови в 3-5 раз ниже, чем у плодов соответствующего возраста, но выше, чем у 36-дневных крыс (рис. 1). Концентрация ГРГ в крови самок на 18-й день беременности достоверно выше, чем на 21-й день. У оперированных беременных самок уровень ГРГ в крови оказался в 6 раз выше, чем у интактных (неоперированных) и не отличался от уровня ГРГ у контрольных плодов (рис. 1, 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На п

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком