БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 1, с. 31-40
УДК 581.1
МУТАНТ АрБЪО СМатуйотопаБ геткагйШ СПОСОБЕН К ФОРМИРОВАНИЮ ФОТОХИМИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА ФОТОСИСТЕМЫ 2
© 2009 г. А. В. Пиголев, С. К. Жармухамедов, В. В. Климов
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 2; факс: (496) 733-0532; электронная почта: alexey-pigolev@rambler.ru
Поступила в редакцию 19.08.2008 г.
Исследовали функциональное состояние фотосистемы 2 (ФС-2) в клетках темновой культуры штамма \psbO СЫатуйототз тикали, дефицитного по Мп-стабилизирующему белку водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС-2. Показано, что при темновой инкубации в гетеротрофных условиях в клетках мутанта формируется стабильный комплекс ФС-2, что подтверждают результаты определения содержания белка Б1 и пигментного состава клетки. Несмотря на отсутствие фотосинтетического выделения кислорода, выявлена фотохимическая активность реакционного центра ФС-2. Отношение переменной флуоресценции хлорофилла (^у) к максимальному уровню флуоресценции (^у/^т), характеризующее эффективность преобразования энергии света в ФС-2, составляло 0.37 или 66% от подобной величины у темновой культуры дикого типа. Анализ индукционной кривой показывает, что отсутствие кислород-выделяющей активности в культуре мутанта может быть связано с нарушениями в организации марганцевого кластера ВОК. О повреждении на донорной стороне ФС-2 свидетельствуют снижение скорости донирования электронов от ВОК к реакционному центру ФС-2 и наличие промежуточного пика увеличения флуоресценции на участке темновой релаксации Полученные результаты свидетельствуют о том, что в отсутствие Мп-стабилизирующего белка в клетках С. тпкаг^й происходит образование фотохимически активного стабильного реакционного центра ФС-2, неспособность которого к окислению воды объясняется нарушениями в процессе формирования и/или поддержания стабильности неорганического Мп-содержащего ядра ВОК.
Марганец-стабилизирующий белок (МСБ) является обязательным компонентом водоокисляющего комплекса (ВОК) всех оксигенных фотосин-тезирующих организмов [1-3], хотя его роль в процессе фотосинтетического окисления воды остается невыясненной. Вместе с другими внешними белками водоокисляющего комплекса МСБ участвует в стабилизации Мп-содержащего энзи-матического центра и в обеспечении оптимальных скоростей фотосинтетического выделения кислорода. Удаление МСБ из субхлоропластных препаратов фотосистемы 2 (ФС-2) приводит к снижению скорости выделения кислорода и повышает уязвимость реакционного центра (РЦ) ФС-2 к фотоинактивации [4, 5]. Кроме того, инкубация препаратов ФС-2 в отсутствие МСБ приводит к дестабилизации Мп-кластера и сопровождается потерей двух из четырех атомов марганца, входящих в состав неорганического ядра ВОК [4-7]. Однако кис-лород-выделяющая активность (как и стабильность марганцевого кластера) может быть сохра-
Сокращения: ФС-2 - фотосистема 2; МСБ - марганец-ста-билизирующий белок; ВОК - водоокисляющий комплекс; РЦ - фотохимический реакционный центр; ССК - светосо-бирающий комплекс; ЭТЦ - электрон-транспортная цепь; ДБМИБ - 2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-п-бензохинон; ДХБХ - 2,6-дихлор-п-бензохинон.
нена в присутствии высоких концентраций С1 (200 мМ) [4, 8].
Генетические исследования показали, что мутация в МСБ приводит к развитию специфического фенотипа, зависящего от эволюционного положения организма. Так, инактивация гена, кодирующего МСБ, у высших растений (Arabidopsis tkaliana) с помощью РНК-интерференции (ЯКЛ1) приводит к замедлению роста и гибели растения
[9]. В этом случае отсутствие МСБ сопровождается потерей пигмент-белкового комплекса ФС-2 и неспособностью растения к фотоавтотрофному росту. Исследование мутанта Ар8ЬО зеленой водоросли Cкlamydomonas reinкardtii (РиБ44) показало, что мутация приводила к потере кислород-выделяющей активности и отсутствию роста в фотоавто-трофных условиях [10]. В случае инкубации культуры мутанта в миксотрофных условиях (на свету в присутствии ацетата) в клетках С. reinкardtii не наблюдалось образования стабильного комплекса ФС-2 [10, 11], несмотря на то, что синтез других белков, входящих в состав ФС-2, не был нарушен
[10]. При этом содержание белков, входящих в РЦ ФС-2 (Б1, Б2 и др.), составляло только 10% от содержания в клетках дикого типа [10], а из анализа фотоиндуцированных изменений поглощения при 515 нм может следовать, что уровень активных
центров ФС-2, способных к разделению зарядов в РЦ ФС-2, снижается на 70% [11]. В этом случае остается невыясненным, собирается ли в отсутствие МСБ функционально активный комплекс ФС-2, способный к фотосинтетическому окислению воды, который в дальнейшем подвергается деградации, или же отсутствие МСБ приводит к блокированию определенных стадий в формировании ФС-2. Следует отметить, что в отличие от эукариотических организмов (высшие растения и водоросли), у которых в случае мутации гена р&ЬО не наблюдается образования стабильного комплекса ФС-2 и фотосинтетического выделения кислорода, клетки цианобактерий способны к формированию ФС-2 и даже к осуществлению фотоокисления воды в отсутствие МСБ. Так, мутант \psbO Synechocystis sp. РСС 6803 способен к фото-автотрофному росту, хотя кислород-выделяющая активность ФС-2 нестабильна и снижена по сравнению с клетками дикого типа и для ее проявления требуется другой белок ВОК - цитохром С550 [12]. Кроме того, фотохимическая активность ФС-2 в клетках мутанта цианобактерий ингибируется при высокой интенсивности света, а для ее сохранения требуется присутствие высоких нефизиологических концентраций Са2+ и С1- [12, 13].
Поскольку одной из причин, по которой не выявляется образование стабильного комплекса ФС-2 в клетках мутантов высших растений и водорослей, может быть высокая чувствительность ФС-2 к фотоинактивации, в данной работе была использована темновая культура клеток водоросли С. гет-hardtii. В отличие от большинства фотосинтези-рующих организмов С. гeinhaгdtii не является облигатным фотоавтотрофом и способна расти в темноте, используя ацетат в качестве источника углерода [13-15]. Подобная особенность клеток С. геМаМШ позволила выделить большое число мутантов с нарушением биогенеза и функционирования фотосинтетического аппарата, в том числе, белков ВОК ФС-2.
Таким образом, цель нашей работы состояла в выяснении возможности образования фотохимически активного комплекса ФС-2 в клетках темно-вой культуры С. геМаМШ в отсутствие Мп-стаби-лизирующего белка ВОК ФС-2, а также в функциональной характеристике темновой культуры мутанта, в том числе, в оценке состояния ФС-2 и значимости МСБ в формировании и поддержании стабильности комплекса ФС-2. Если бы удалось установить, что в отсутствие МСБ в клетках С. ге-МаМШ образуется фотохимически активный комплекс ФС-2, то это позволило бы в дальнейшем использовать гетеротрофную культуру С. ге-МаМШ в качестве модельной системы для сайт-направленного мутагенеза Р8ЬО. Поскольку в отличие от других моделей, используемых в настоящее время для исследования функции МСБ (мутанты цианобактерий и высших растений, рекон-
струкция ВОК модифицированным белком в изолированных препаратах ФС-2), выращивание клеток C. reinhardtii в темноте позволяет изучать функциональное состояние РЦ и биогенез комплекса ФС-2 in vivo в условиях, исключающих повреждение донорной стороны ФС-2 вследствие фотоинактивации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объекта исследования использовали культуры клеток C. reinhardtii следующих штаммов: дикого типа (137c mt+) и ApsbO (СС 2892; FUD44), дефицитного по МСБ (коллекция Chlamy-domonas Genetics Center, Duke University, США) вследствие встраивания ретротранспозон-подоб-ного элемента (TOC1) в кодирующую область гена psbO [10, 16].
Клетки выращивали на трис-ацетат-фосфат-ной среде (ТАР, pH ~7.0) [17] при постоянном перемешивании, используя два световых режима: в "темноте" (0.05-0.1 мкмоль м-2 с1) и при постоянном освещении (~100 мкмоль м-2 с-1). Температура инкубации составляла 21 ± 2°С. Эти условия выращивания подобны стандартным, используемым при выращивании световых и темновых культур клеток C. reinhardtii.
Исследования проводили на культурах, находящихся в середине экспоненциальной фазы роста (плотность 2-4 х 106 клеток мл-1). Для получения темновой культуры с подобными характеристиками световую культуру с концентрацией клеток 810 х 106 клеток мл-1 пересевали на свежую среду с начальной плотностью суспензии 0.5 х 106 клеток мл-1. После этого культуру инкубировали в темноте в течение 76-92 ч. За это время в культуре происходило в среднем 2-3 темновых деления и осуществлялся переход в логарифмическую фазу роста с достижением требуемой концентрации клеток.
Для расчета параметров кривой роста культуру клеток, находящуюся в экспоненциальной фазе, пересевали в колбы со свежей средой и инкубировали в темновых и световых условиях. Начальная плотность культуры составляла 2.5 х 104 клеток мл-1. Условия инкубации соответствовали условиям, описанным выше. Скорость роста оценивали по изменению плотности клеточной суспензии через каждые 12 ч (первые 5 дней инкубации) и далее каждые 24 ч. Удельную скорость роста рассчитывали по формуле:
| = (ln Xt -ln X 0/( t -t0),
где Xt и X0 - плотность клеточной суспензии в момент времени соответственно t и t0. Время удвоения биомассы (td) определяли как:
td = ln2/|[ 18 ].
МУТАНТ ApsbO Chlamydomonas reinhardtii
33
Подсчет клеток, предварительно фиксированных добавлением спиртового раствора Люголя, проводили с помощью камеры Горяева. Содержание пигментов определяли спектрофотометриче-ским методом в 80% ацетоне [19].
Скорость фотоиндуцированного выделения и поглощения О2 культурой клеток C. reinhardtii измеряли полярографическим методом с помощью электрода Кларка в ячейке объемом 1 мл, при освещении светом насыщающей интенсивности (более 1500 мкмоль м-2 с1). Образец культуры клеток переносили в измерительную ячейку и инкубировали в темноте в течение 5 мин при 23°С. Фотовыделение кислорода измеряли в присутствии экзогенных акцепторов электронов: 100 мкМ 2,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.