ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 5, с. 608-616
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 579.22+579.25
МУТАНТЫ Burkholderia cenocepacia С ИЗМЕНЕННЫМ СИНТЕЗОМ N-АЦИЛ-ГОМОСЕРИНЛАКТОНОВ - СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ
Quorum Sensing РЕГУЛЯЦИИ
© 2012 г. М. А. Веселова1, В. А. Липасова1, Ю. В. Зайцева1, О. А. Кокшарова13, М. Ю. Чернуха2, Ю. М. Романова2, И. А. Хмель1
1 Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва 123182
e-mail: khmel@img.ras.ru
2 Государственное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва 123098 3 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва 119899 Поступила в редакцию 30.09.2011 г.
С помощью пласпозонного мутагенеза получены мутанты Burkholderia cenocepacia 370 с измененной продукцией N-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ) — сигнальных молекул Quorum Sensing системы регуляции. Для определения локализации вставок пласпозонов у мутантных штаммов проведены клонирование фрагментов хромосомной ДНК, содержащих пласпозоны, секвенирование прилежащих к ним участков ДНК и поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей в банке генов. Показано, что инсерция пласпозона в ген lon, кодирующий протеиназу Lon, приводит к резкому уменьшению синтеза АГЛ. При инсерции пласпозона в ген pps, кодирующий фосфоенолпируват-синтазу, наблюдается увеличение продукции АГЛ. В мутанте с инактивированным геном lon было отмечено резкое снижение внеклеточной протеазной, гемолитической и хитинолитической активностей по сравнению с исходным штаммом и не наблюдались изменения липазной активности. Мутация в гене pps не влияла на эти свойства B. cenocepacia 370. Мутации в генах lon и pps снижали вирулентность бактерий при заражении мышей.
Бактерии способны чувствовать повышение плотности популяции и отвечать на него быстро и скоординированно. Этот специфический тип регуляции получил название Quorum Sensing (QS). QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы различной химической природы (аутоиндукторы) и регуляторные белки, с которыми взаимодействуют сигнальные молекулы. При повышении плотности популяции аутоиндукторы накапливаются до необходимого порогового значения, что чаще всего приводит к резкой активации транскрипции определенных наборов генов во всей популяции бактерий. QS системы являются глобальными факторами экспрессии бактериальных генов, они играют ключевую роль в регуляции различных процессов метаболизма бактерий, например участвуют во взаимодействии бактерий с высшими организмами, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, различных ферментов и др. [1, 2]. Лучше всего изучены QS системы, функционирующие с участием сигнальных молекул N-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ).
Бактерии комплекса Burkholderia cepacia широко распространены в природе, они обитают в различных экологических нишах — выделяются из инфицированных людей, почвы, воды, ризосферы растений и др. Некоторые штаммы этого комплекса, в том числе B. cenocepacia, вызывают внутрибольничные инфекции, главным образом у людей, больных кистозным фиброзом (муко-висцидозом), хроническим грануломатозом, у пациентов со сниженным иммунитетом. Бактерии B. cenocepacia содержат по крайней мере три системы QS регуляции, которые участвуют в контроле вирулентности: CepI/CepR, CciI/CciR (эти системы используют АГЛ в качестве сигнальных молекул), недавно была обнаружена еще одна QS система, которая функционирует с участием сигнальной молекулы иной природы — BDSF (cis-2-dodecenoic acid) [3—6].
Было показано, что в большинстве случаев при легочных инфекциях больных кистозным фиброзом бактерии В. cepacia участвуют в инфекционном процессе вместе с Рseudomonas aeruginosa [7]. Бактерии комплекса В. cepacia синтезируют мало АГЛ, обычно это N-октаноил-гомосеринлактон (С8-ГСЛ) и в значительно меньшем количестве N-гексаноил-гомосеринлактон (С6-ГСЛ), Р. aerugi-
Таблица 1. Штаммы бактерий, использованные в работе
Штаммы бактерий Характеристика штаммов Источник
Burkholderia cenocepacia 370 Клинический изолят Коллекция НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Chromobacterium violaceum (CV026) Биосенсор для определения АГЛ. Продукция виолацеина. Smr mini-Tn5 Hgr cviI::Tn5 xylE Kmr [14]
Agrobacterium tumefaciens NT1/pZLR4 Биосенсор для определения АГЛ. Gmr Cbr [16]
Escherichia coli S17-1 thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Тс*::Ми) (KmR::Tn7) Ipir Коллекция Института молекулярной генетики РАН
Escherichia coli S17-1/pTnMod-RKmR S17-1, несет пласпозон TnMod-RKmr. Используется для пласпо-зонного мутагенеза [18]
nosa синтезируют намного больше АГЛ. Добавление к В. cepacia очищенной от клеток среды, на которой росла до высокой плотности популяции культура Р. aeruginosa, приводило к увеличению синтеза факторов патогенности — 2-кратному увеличению синтеза протеаз и 7-кратному сиде-рофоров. То есть В. cepacia может использовать АГЛ, синтезированные Р. aeruginosa [3, 8—10].
Было показано, что CepI-CepR QS система положительно регулирует экспрессию внеклеточных протеаз, хитиназ, полигалактуроназы, миграцию бактерий по поверхности среды (свор-минг, swarming) и образование биопленок, репрессирует синтез сидерофора орнибактина и участвует в регуляции вирулентности бактерий [3, 5, 11, 12]. CciI-CciR QS система также вовлечена в регуляцию патогенности В. cepacia. Обе QS системы определяют синтез С8-ГСЛ и С6-ГСЛ, при этом CepI-CepR QS система катализирует синтез С8-ГСЛ в 8—10 раз большем количестве, чем С6-ГСЛ, а CciI-CciR QS система катализирует синтез АГЛ в обратном соотношении [3, 5, 6]. Регуляция экспрессии генов, участвующих в функционировании QS систем В. cepacia (включая В. cenocepacia), и роль QS систем в регуляции клеточных процессов этих бактерий исследованы недостаточно.
В настоящей работе с целью изучения генетического контроля синтеза сигнальных молекул АГЛ были получены пласпозонные мутанты В. cenocepacia 370 с измененной продукцией АГЛ. В мутантном штамме с резко сниженным синтезом АГЛ инсерция пласпозона была локализована в гене lon, кодирующем протеиназу Lon. Мутация, приводящая к увеличению синтеза АГЛ, была локализована в гене pps, кодирующем фосфоенол-пируватсинтазу. Изучено влияние мутаций на активность нескольких ферментов и вирулентность бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий и условия культивирования
Штаммы бактерий, использованные в работе, приведены в табл. 1. Для выращивания культур бактерий использовали среды Luria Broth (LB), агаризованный (1.5%) LB (LA) и M9 c необходимыми добавками [13]. Культуру гриба Sclerotinia sclerotiorum (из коллекции Института молекулярной генетики РАН) выращивали на среде PDA (Sigma). Выращивание культур бактерий проводили при температуре 30°C, выращивание грибов — при 25°C. Антибиотики отечественного производства использовали в концентрациях (мкг/мл): ампициллин 100—200; канамицин 100; гентами-цин 40. Тетрациклин (Sigma) использовали в концентрации 20 мкг/мл.
Определение продукции АГЛ
Для определения продукции АГЛ использовали два биосенсора. Первый сенсор Chromobacteri-um violaceum CV026 высевали штрихами на поверхность среды LA, пересекали их штрихами тестируемых культур, инкубировали 24—48 ч при 30°С. В случае, когда штамм продуцировал АГЛ, наблюдали окрашивание индикаторного штамма (CV026) в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски оценивали визуально [14, 15].
Второй биосенсор Agrobacterium tumefaciens NT1/pZLR4 выращивали на среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и гентамицина в течение ночи при 30°С. Чашку с агаризованной средой М9 с добавленным X-Gal (конечная концентрация 80 мкг/мл) заливали 3 мл M9 c 0.5% агара с добавлением 0.5 мл ночной культуры A. tumefaciens NT1/pZLR4. Тестируемые на продукцию АГЛ штаммы высевали уколами на поверхность агаризованной среды после ее застывания или добавляли жидкую ночную культуру в
лунки в агаризованной среде, инкубировали при 30°С 24—48 ч. О синтезе АГЛ тестируемыми штаммами судили по появлению голубых зон гидролиза X-Gal [16].
Тонкослойная хроматография АГЛ
Для идентификации АГЛ в культуральных экстрактах использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) [16]. 200 мл ночной культуры центрифугировали с охлаждением, супернатанты смешивали с этилацетатом, содержащим 0.1% ледяной уксусной кислоты (v/v). Экстракцию АГЛ проводили в течение 30 мин при встряхивании два раза, этилацетатные фракции объединяли. Остатки воды в этилацетатной фазе убирали добавлением Na2SO4. Этилацетат выпаривали на роторном испарителе при 37°С, остаток собирали, упаривали досуха на SpeedVac и хранили при —20°С. Пробы, содержащие культуральные экстракты или синтетические АГЛ-стандарты (Sig-ma-Aldrich), помещали на обращенно-фазовые ТСХ-пластинки RP18 (Merck, Германия) и разделяли, используя в качестве растворителя 60%-ный раствор метанола в воде. После окончания хроматографии пластинки высушивали и заливали мягким агаром, содержащим биосенсоры (0.7% LA в случае штамма C. violaceum CV026 и 0.7% М9 с 0.4% глюкозы и X-gal в случае A. tume-faciens NT1/pZLR4). После инкубации при 28°С определяли локализацию пятен визуально, по появлению фиолетовой окраски сенсорного штамма CV026 и голубых зон гидролиза X-Gal в случае сенсора NT1/pZLR4.
Метчики АГЛ использовали в концентрации 0.01 мг/мл (С6-ГСЛ) и 0.1 мг/мл в случае N-бута-ноил-гомосеринлактона (С4-ГСЛ), N-^-оксо)-гексаноил-гомосеринлактона (3ОС6-ГСЛ) и (С8-ГСЛ). В случае биосенсора C. violaceum CV026 метчики АГЛ наносили на пластинку в количестве: С6-ГСЛ - 5 мкл, С4-ГСЛ - 7 мкл, 3ОС6-ГСЛ — 5 мкл, С8-ГСЛ — 2 мкл; в случае биосенсора A. tumefaciens NT1/pZLR4 — в количестве 5 мкл С6-ГСЛ, 1 мкл С4-ГСЛ, 1 мкл 3ОС6-ГСЛ и 1 мкл С8-ГСЛ.
Конечный объем экстрактов супернатантов В. cenocepacia 370 и мутанта В2 составлял 160 мкл, мутанта B10 — 20 мкл (т.е. в 8 раз более концентрированный). Экстракты наносились в количе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.