ш
УДК 547.963.32+577.21
МУТАНТЫ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА
© 1996 г. JI. Н. Шингарора, Л. Н. Сагайдак, Р. Л. Турсцкая*+, С. А. Недоспасов*+, Д. С. Есипов, В. Г. Коробко#
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; * Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, Москва; + Национальный институт рака, Фредерик, Мэриленд, США Поступила в редакцию 24.11.95 г.
С помощью полимеразной цепной реакции получены мутантные гены фактора некроза опухолей человека (TNF-a), кодирующие белки с аминокислотными заменами и делециями (мутеины). Среди них мутанты R32H, A33S, F144L, II i8M, I118A, двойной мутантR32H-F144L и мутант с делецией четырех аминокислотных остатков 67-70. Мутантные гены экспрессированы в Е. coli под контролем конститутивных промоторов. Разработан простой метод выделения мутеинов и исследованы их физико-химические свойства. С помощью спектров КД и кросс-сшивок показано, что все полученные мутанты, за исключением F144L и 1118А, образуют пространственную структуру, сходную с TNF-a. Исследованы биологические свойства мутеинов. Установлено, что мутеины R32H и A33S обладают пониженной цитотоксичностью в отношении мышиных фибробластов L929, в то время как мутант F144L и двойной мутант R32H-F144L оказались практически неактивными.
Ключевые слова; фактор некроза опухолей человека (TNF-a), мутанты, полимеразная цепная реакция, экспрессия в Е. coli.
Фактор некроза опухолей СПЧБ-ос), один из центральных белковых иммуномедиаторов и провоспалителькый цитокин, продуцируемый в основном активированными макрофагами, был первоначально охарактеризован как белок, вызывающий некроз экспериментальных опухолей у мышей [11- Противоопухолевое действие 'ШБ-а представляет собой сложный процесс и может быть результатом воздействия фактора на клетки как сосудистого эндотелия, так и иммунной системы \2]. Собственно индуцированный ТОБ-а некроз опухолей происходит, по-видимому, в результате активации эндотелия и последующих прокоагуляторных эффектов [3]. С другой стороны, как центральный медиатор воспаления ТЫБ-а вызывает сильные системные эффекты вплоть до септического шока [4], что ограничивает его применение для лечения опухолей ("5]. В последние годы разработаны методы местного противоопухолевого применения ТНР-а, причем наибольший успех был достигнут при лечении мела-ном и сарком конечностей комбинацией Т1ЧР-а,
Сокращения: ТИР-сс - фактор некроза опухолей; Т№К - рецептор фактора некроза опухолей; РМЭР - фенилметил-сульфонилфторид; в формулах олигодезоксирибонуклео-тидов префикс "с!" для краткости опущен. # Автор для переписки.
интерферона-у и химиотерапии при регионарной перфузии [6].
Разнообразие биологических свойств ТОТ-а опосредовано двумя высокоаффинными рецепторами, Т№К55 и ПЧРЯ75, которые являются также и рецепторами лимфотоксина-а, родственного Ж-а растворимого цитокина [7-9]. Один из рецепторов, ТЫРК55, универсален и представлен на поверхности практически всех клеток, тогда как другой, Т№К75, чаще встречается на поверхности гемопоэттических клеток [10, 11], а также на клетках эндотелия [12]. Существование двух рецепторов для одного белка позволило предположить, что они модулируют разные биологические свойства этого цитокина. В частности, сообщалось, что рецептор Т№Т175 вносит основной вклад в развитие системной токсичности ТЫР-а [4, 13]. Перспективным подходом к выявлению функционально важных участков для лиганд-ре-цепторных взаимодействий является создание мутантов ТЫР-а, взаимодействующих специфически с одним из двух типов рецепторов [14]. Это может привести к получению новых форм цитокина, обладающих меньшей общей токсичностью, но сохраняющих высокую цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам. Настоящая работа
Рис. 1. Пространственная структура мономерной молекулы ТЫР-а в соответствии с работой [20]. Стрелками показано положение мутаций.
посвящена получению мутантов TNF-a (мутеи-нов) с новыми свойствами.
Ранее нами был клонирован фрагмент генома человека, содержащий гены фактора некроза опухолей и лимфотоксина-се (TNF-ß) [15]. На его основе был сконструирован полусинтетический ген, кодирующий TNF-a без двух N-концевых аминокислот [16]. Этот ген был помещен в плаз-миде pTNF31 под контроль двух конститутивных промоторов, А2 и A3, из ранней области бактериофага Т7 и синтетической последовательности Шайна-Дальгарно. Такая конструкция обеспечивала высокий уровень биосинтеза рекомбинант-ного TNF-a клетками Е. coli штамма SG20050. Ранее были получены мутантные белки TNF-a, содержащие точечные замены в С-концевой части молекулы [17, 18]. Исследование биологических свойств мутантов показало важную роль этого участка в проявлении биологической активности
Т№-а. В то же время не удалось получить мутанты с пониженной общей токсичностью.
В настоящей работе продолжен поиск мутантов Т№-а с измененной биологической активностью. Выбор положения и типа мутации был сделан с использованием предсказательной компьютерной программы Рго_Апа1 [19]. Эта программа, предназначенная для анализа связи между структурой и функцией белков и пептидов, учитывает вклад каждого аминокислотного остатка в формирование пространственной структуры функциональных доменов белка. Таким образом-, были определены три участка молекулы ТОТ-а, мутации в которых предположительно должны изменить биологические свойства белка.
Наиболее интересная для мутагенеза область располагается в первой петле (рис. 1), которая принимает участие в связывании с рецептором TNFR55, как это было показано с помощью
TNFDEL
TNF118А, TNF1 IBM
TNFF144L
TNFR32H
TNFA33S
мутационного анализа [21, 22]. Участие этого района молекулы лиганда во взаимодействии с TNFR55 было прямо подтверждено рентгеност-руктурным анализом комплекса растворимого рецептора TNFR55 с лимфотоксином (TNF-J3) [23], обладающим сходной с TNF-a пространственной структурой [24]. Мы запланировали получение двух мутантов по первой петле с заменами R32H и A33S.
Второй выбранный нами участок молекулы TNF-a располагается в последней петле, которая пространственно сближена с первой петлей. Согласно данным работы [23], аминокислотные остатки 155-159 TNF-p участвуют в контактах с рецептором. Им соответствуют аминокислоты 139-144 TNF-a. Поэтому была выбрана мутация, приводящая к замене фенилаланина в положении 144 на лейцин (мутант F144L). Введение одновременно дополнительной мутации R32H предположительно должно усиливать влияние замены F144L.
Третий участок молекулы TNF-a, представляющий интерес для мутагенеза по данным компьютерного анализа, расположен в месте "пересечения" двух (3-складок. Для мутагенеза был выбран остаток изолейцина в положении 118, который заменяли на метионин (II18М) или аланин (I118A).
Наконец, еще одна мутация (Del 167-70) - деления четырех аминокислотных остатков 67-70 (QGCP) из неупорядоченного участка между третьим и четвертым тяжами (рис. 1). По данным работы [23], соответствующий участок TNF-J3 не вовлечен в контакты с рецептором TNFR55. С другой стороны, удаление этого фрагмента из молекулы лимфотоксина значительно увеличивало его цитотоксичность in vitro по отношению к линии клеток аденокарциномы кишечника и аффинность связывания с поверхностными рецепторами мышиных фибробластов и человеческой клеточной линии WiDR [25].
Мутагенез проводили с помощью двухступенчатой ПЦР. В качестве источника гена TNF-a использовали плазмиду pTNF33l (рис. 2) - производную плазмиды pTNF31 [16]. Например, для получения гена, кодирующего мутант R32H, на первом этапе проводили амплификацию З'-кон-цевой части гена при помощи якорного праймера ATATCACCAGCTCACCGT (XIV) (табл. 1), комплементарного участку плазмиды pTNF31 за терминирующим кодоном, и мутагенизирующего праймера CTGAACCGCCATGCCAATGCCCT (I) и амплификацию 5'-концевой части гена с помощью частичного комплементарного олигонукле-отиду (I) праймера GGCATTGGCATGGCGGTTC-AGCC (II) и второго якорного праймера TCGAT-AAATTCGGTACCTAA (XIII), соответствующего участку плазмиды pTNF331 непосредственно пе-
Рис. 2. Схема плазмиды для конструирования и экспрессии мутантных генов TNF-a: Inf - ген TNF-a, Ыа - ген ß-лактамазы, Рд2 и Рдз - промоторы А2 и A3 ранней области фага Т7.
ред участком инициации трансляции. На следующем этапе очищенные с помощью электрофореза в агарозном геле продукты первых реакций амплификации отжигали и проводили ПЦР с использованием только якорных праймеров. В результате получили фрагмент ДНК, содержащий мутантный ген TNF-a. На заключительном этапе продукты ПЦР гидролизовали рестриктазами Крп\ и В gil и образовавшийся небольшой фрагмент клонировали в плазмиду pTNF331 по тем же сайтам с помощью мультикомпонентного лиги-рования.
Аналогичным образом были получены остальные мутантные гены. Следует отметить, что, выбирая последовательности изменяемого кодо-на в мутагенизирующих олигонуклеотидах, мы принимали во внимание, во-первых, частоту использования данного кодона в геноме Е. coli и, во-вторых, возможность введения удобных рест-риктных сайтов или уничтожения сайта в исходном векторе для упрощения последующего анализа. Так, плазмиды с генами, кодирующими мутанты R32H и A33S, содержат на один сайт НаеIII меньше, тогда как в плазмиде с геном мутанта Fl 44L на один сайт Нае III больше, чем в исходной плазмиде pTNF331.
Стратегия сборки рекомбинантных плазмид была направлена на использование максимально коротких фрагментов, образующихся после гидролиза продуктов ПЦР соответствующими рестриктазами (табл. 1). Это уменьшало вероятность появления ошибок при амплификации и облегчало последующее секвенирование встроенного фрагмента. Таким образом, были сконструированы плазмиды pTNFR32H, pTNFR33S, pTNFF144L, pTNFIllSM, pTNFIl 18А и pTNFDel. Плазмида
Таблица 1. Структуры мутагенизирующих и якорных олигонуклеотидных гтраймеров и сайты рестриктаз для клонирования мутантных фрагментов гена Т№-ос
Мутант Олигонуклеотид 5' 3' Сайты рестрикции
R32H CTGAACCGCCATGCCAATGCCCT (I) GGCATTGGCATGGCGGTTCAGCC (II) Kpnl, Bgñ
A33S AA
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.