БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 10, с. 1355 - 1367
УДК 577.112
МУТАНТЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА mRFP1 ПО ОСТАТКУ 66: МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУР МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ И ПОИСК КОРРЕЛЯЦИЙ С ОПТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ*
© 2008 г. Е.Е. Храмеева1, В.Л. Друца2, Е.П. Вржещ1, Д.В. Дмитриенко3, П.В. Вржещ1,3**
1 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-4218, электронная почта:peter@genebee.msu.ru
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-0338, электронная почта: drutsa@genebee.msu.ru
3 Международный биотехнологический центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-5022
Поступила в редакцию 04.02.08 После доработки 17.03.08
С целью исследования связи между оптическими свойствами флуоресцентных белков и их структурой проведено молекулярно-динамическое моделирование структур мутантных белков на основе мономерного красного флуоресцентного белка mRFPl со всеми возможными единичными точечными аминокислотными заменами остатка Glu66 (кроме замены на Pro). Для хромофоров и их окружения (6А) в белке дикого типа, Q66A, Q66L, Q66S, Q66C, Q66H и Q66N был осуществлен глобальный поиск корреляций геометрических параметров структур с определенными нами оптическими свойствами (длина волны в максимуме поглощения, интегральный коэффициент экстинкции в максимуме поглощения, длина волны в максимуме возбуждения флуоресценции, длина волны в максимуме эмиссии флуоресценции и квантовый выход флуоресценции). Наиболее высокие коэффициенты корреляции (0,81—0,87) обнаружены для торсионных углов фенольного и имидазолидонового колец, а также располагающихся в областях присоединения фенольного кольца к имидазолидоновому кольцу и хромофора к Р-баррелю. Найденные корреляции позволят прогнозировать оптические свойства флуоресцентных белков на основании их структур, а также выделять позиции, наиболее важные для направленного мутагенеза.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: флуоресцентные белки, mRFPl, мутанты по положению 66, оптические свойства, структура, корреляции, молекулярная динамика.
Флуоресцентные белки являются наиболее широко используемыми маркерами для визуализации процессов, происходящих в интактных биологических системах. Семейство флуоресцентных белков включает в себя белки различных представителей типа кишечнополостных (Сое1-еП:ега1а), способные поглощать и испускать свет
Принятые сокращения: GFP — зеленый флуоресцентный белок из Aequorea Victoria (Green Fluorescent Protein), DsRed — красный флуоресцентный белок drFP583 из коралла Discosoma sp., mRFPl — мономерный красный флуоресцентный белок, мутант DsRed, Q66X — мутанты mRFPl с заменой 66-го остатка на остаток X, МД — молекулярная динамика.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-038, 14.09.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
в видимой части спектра. Флуоресцентные белки имеют сходную структуру, представленную 11-тяжевым в-баррелем, внутри которого проходит а-спираль с хромофором в ее средней части. Хромофор — это гетерогруппа, образующаяся в результате автокаталитической посттрансляционной реакции между тремя смежными аминокислотными остатками. Его наличие обеспечивает окраску белков и их возможность флуоресциировать [1].
На флуоресценцию белков данного семейства оказывают влияние внешние условия: рН [2, 3], температура [1] и ионный состав среды [4, 5], но определяющими факторами являются строение хромофора и его ближайшего окружения [1, 6]. К настоящему времени описаны представители данного семейства, различающиеся по быстроте созревания, стабильности, оп-
тическим свойствам (спектры поглощения и флуоресценции, квантовый выход флуоресценции, фотовыцветание и пр.) [1, 7], проводятся теоретические, а также экспериментальные и расчетные исследования с целью изучения механизма флуоресценции этих белков [8—11].
Зеленый флуоресцентный белок ОБР был открыт в начале 60-х годов [12], но его активное изучение началось лишь после клонирования гена ОБР в 1992 г. [13] и демонстрации его гете-рологической экспрессии в других организмах. В 1999 г. другое семейство окрашенных белков, включающее красный белок было кло-
нировано из кораллов [14]. Однако белок является тетрамером, и его использование в качестве флуоресцентной метки ограничено из-за возможного влияния большого молекулярного веса тетрамера на функционирование изучаемого белка или его токсического воздействия на клетку.
Первым мономером, полученным из красного флуоресцентного белка стал шКРР1, для создания которого потребовалось осуществить в 33 аминокислотные замены [15]. Для флуоресцентного белка шКРР1 также характерно красное излучение, и поэтому он представляет особый интерес с точки зрения минимизации фонового сигнала [16]. Хотя флуоресцентный белок шКРР1 уже широко используется в клеточной биологии, в настоящее время продолжаются работы по получению новых форм красных флуоресцентных белков с целью улучшения их свойств: квантового выхода, яркости, фото- и рН-стабильности и пр.
В то же время необходимая для развития данного направления взаимосвязь между оптическими свойствами флуоресцентных белков и их структурой практически не изучена. Отсутствует методика прогнозирования свойств флуоресцентных белков на основании их структур, т.е. общий алгоритм дизайна белков с заранее заданными свойствами не разработан. Такая задача может быть решена путем анализа свойств мутантных белков, содержащих единичные точечные аминокислотные замены, с последующим моделированием их структур ¡и яШео методом молекулярной динамики (МД) для поиска корреляций параметров структур с оптическими свойствами.
В данной работе проведено моделирование структур мутантных белков на основе мономерного красного флуоресцентного белка шЯРР1 с 18 единичными точечными заменами остатка О1и-66 с помощью методов молекулярной динамики, получены мутантные белки, в которых О1и-66 заменен на остатки аланина, лейцина, серина, цистеина, гистидина или аспарагина, и
осуществлен поиск связи характеристик рассчитанных структур с оптическими свойствами полученных нами мутантных белков.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для проведения МД-расчетов в данной работе был использован программный пакет GROMACS [17, 18].
Силовое поле. Для МД-расчета траектории белка в выбранном силовом поле должны быть заданы параметры потенциалов взаимодействия всех атомов в молекуле белка. В случае флуоресцентных белков необходимо иметь такие параметры также для атомов хромофора, встроенного в белковую цепь как аминокислотный остаток. Для МД-расчетов было выбрано расширенное силовое поле OPLS-AA/DsRed1 [19], так как в данном силовом поле параметризован хромофор красного флуоресцентного белка DsRed, что дает возможность проводить МД-расчеты всех белков, содержащих хромофор DsRed, в том числе расчеты мутантов белка mRFP1.
Хромофоры 18 мутантов белка mRFP1 (кроме пролинового) схожи с хромофором белка DsRed, за исключением участка, подвергшегося замене в результате мутации по положению 66. Поэтому новая параметризация для данных хромофоров не требовалась, а в качестве параметров для замещающих боковых радикалов по положению 66 использовались параметры соответствующих аминокислотных остатков, для чего в файле силового поля *.rtp (*.rtp — residue topology parameter file) с параметрами топологии аминокислотных остатков были созданы записи для каждого из параметризуемых хромофоров — прописаны типы атомов, новые связи, валентные и торсионные углы, заряды атомов и параметры ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Также был отредактирован файл силового поля *.hdb (*.hdb — hydrogen data base), в котором каждому атому водорода приписывается один из девяти возможных наборов параметров в соответствии с его типом [20]. Таким образом, в силовом поле OPLS-AA/DsRed1 были параметризованы хромофоры каждого из 18 мутантов белка mRFP1.
Задание исходной структуры. Поскольку mRFP1 — мутант DsRed, есть основание полагать, что трехмерная структура мономера mRFP1 будет аналогична структуре субъединицы тетраме-ра белка DsRed. В качестве исходной структуры при проведении МД-расчетов белка mRFP1 была использована структура субъединицы белка DsRed (PDB ID: 1ZGO), файл со структурой получен на сайте (http://www.pdb.org) Protein Data
Bank [21, 22]. В данном файле содержится информация о координатах атомов тетрамера белка DsRed (за исключением атомов водорода) по данным рентгеноструктурного анализа кристалла этого белка [23].
Чтобы получить модель структуры mRFP1, PDB-файл 1ZGO был модифицирован путем внесения 33 аминокислотных замен при помощи программы Swiss-PdbViewer [24], после чего на основании такой модели были созданы PDB-файлы для каждого из мутантов mRFP1, содержащие соответствующие замены в 66-м положении. Такие модели после проведения минимизации энергии использовались для МД-расчетов.
Проведение МД-расчетов. С помощью программы mdrun проводилась процедура минимизации энергии систем [25]. Для нахождения энергетического минимума был применен метод наискорейшего спуска. Параметры: шаг (Emstep) — 0,01 нм, критерий прекращения процедуры — максимальный градиент энергии (Emtol) — 2000 кДж/(моль • нм). С использованием координатного файла, полученного в результате процедуры минимизации энергии системы, с помощью программы mdrun проводился МД-расчет с ограничением подвижности атомов пептидных цепей. Параметры процедуры: шаг интегрирования 2 фс, общее время расчета 10 пс, термостат Берендсена [26], температура (ref_t) — 300 K, характеристическое время термостата (tau_t) — 0,1 пс. С использованием координатного файла, полученного в ходе МД-расчета с ограничением подвижности атомов пептидных цепей, с помощью программы mdrun проводился МД-расчет траектории систем при 300 K. Параметры МД-расчетов: шаг интегрирования 2 фс, термостат Берендсена, температура (ref_t) — 300 K, характеристическое время термостата (tau_t) — 0,1 пс, изотропный баростат Парринелло—Рахмана, характеристическое время баростата (tau_p) — 0,5 пс, давление — (ref_p)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.