НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 3, с. 247-254
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.831:618.33:616-091.818
НАД+-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА В ОСТРОМ ПЕРИОДЕ ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОГО ПЕРИНАТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ
© 2008 г. А. Б. Салмина*, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская, Т. Е. Таранушенко, А. В. Моргун, Н. С. Манторова, С. В. Михуткина
ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Красноярск
На модели перинатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга крыс обнаружены закономерности изменения активности АДФ-рибозилциклазы клеток коры головного мозга, определяющие особенности реализации запрограммированной клеточной гибели и поддержания внутриклеточного гомеостаза НАД+.
Ключевые слова: НАД+, АДФ-рибозилциклаза, головной мозг, ишемия, апоптоз, перинатальное поражение.
Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение головного мозга является одной из важных причин инвалидизации и смертности. Каскад событий, приводящих к развитию стойкой неврологической дисфункции, включает в себя гипоксию, дефицит энергетических субстратов, нарушение электровозбудимости нейронов, окислительный стресс, микроциркуляторные расстройства, гиперпродукция цитокинов, изменение секреции и рецепции нейротрансмиттеров, развитие апоптоза и некроза [1].
В числе факторов, определяющих чувствительность клеток к действию индукторов клеточной гибели (в том числе при ишемии), метаболизм ни-котинамидадениндинуклеотида (НАД+) и состояние внутриклеточного гомеостаза кальция. НАД+ функционирует не только в качестве кофермента, но и субстрата для ряда НАД+-конвертирующих ферментов. Метаболизм НАД+ в клетках нейро-нальной природы является объектом контроля и регуляции [2], коль скоро состояние пула внутриклеточного НАД+ влияет на метаболическую активность, репликацию и репарацию ДНК, устойчивость к окислительному стрессу, электровозбудимость нейронов. Уровень НАД+ в нейронах определяется активностью НАД+-синтезирующих ферментов, НАД+-регенерирующих метаболических путей, а также НАД+-конвертирующих фер-
* Адресат для корреспонденции: 660022, Красноярск, ул. П. Железняка, д. 1, тел: (+3912) 23-49-49, (+3912) 20-10-71, факс (+3912) 23-78-35, e-mail: allasalmi-na@mail.ru
ментов: 1) АДФ-рибозилтрансфераз, продуцирующих АДФ-рибозу, необходимую для посттрансляционной модификации интегринов, белков цитоскелета, нейрогранина, основного белка миелина, шаперонов, кальциевых АТФаз, ГТФ-связы-вающих белков и других молекул; 2) поли(АДФ-рибозил)полимеразы, функционирующей в качестве сенсора повреждения ДНК и регулирующей активность гистонов, ферментов репарации ДНК, топоизомераз, некоторых транскрипционных факторов, ДНК-зависимых киназ, ламина В и других белков; 3) АДФ-рибозилциклазы/НАД-глико-гидролазы/СБ38, представляющей собой компонент клеточных сигнальных систем, сопряженных с рецепторами ряда нейротрансмиттеров (бради-кининовые, адренергические, пуринергические, гистаминовые, мускариновые ацетилхолиновые и другие), катализирующей образование циклической АДФ-рибозы (цАДФР) и адениндинуклеотид-фосфата никотиновой кислоты, выполняющих функцию мобилизаторов кальция из внутриклеточных депо, а также модуляторов активности калиевых ионных каналов М-типа [3, 4].
Ферментативная активность АДФ-рибозил-циклазы/СБ38 контролируется многими факторами, в частности структурой каталитического центра и сохранностью сульфгидрильных остатков цистеина в его пределах, уровнем внутриклеточных АТФ и НАДН, внутриклеточной локализацией фермента (плазматическая мембрана, ми-тохондриальная мембрана, ядерная мембрана, цитозоль), конформационной пластичностью и способность формировать димеры в мембране
для эффективного транспорта продукта реакции, действием лигандов (НАД+, СБ31). В клетках центральной нервной системы (нейроны, астро-циты) АДФ-рибозилциклаза экспрессируется в различных клеточных компартментах (ядро, ци-тозоль, митохондрии), а также на плазматической мембране, однако до сих пор остаются невыясненными механизмы, контролирующие редис-локацию молекул фермента, роль субклеточной локализации в реализации ферментативной активности, механизмы направленного транспорта фермента в различные компартменты клетки [5-7].
Продукт ферментативной активности СБ38 -циклическая АДФ-рибоза (цАДФР) - является модулятором рианодиновых рецепторов II и III типов за счет специфического связывания с белком РКВР12.6. В астроцитах гипоксия стимулирует высвобождение кальция из внутриклеточных депо в цитоплазму за счет опосредованной цАДФ-рибозой гиперактивации рианодиновых рецепторов [8]. Известно, что пролонгированная внутриклеточная аккумуляция кальция в клетках головного мозга - один из признаков гипоксиче-ски-ишемического повреждения мозга у незрелых животных [9].
По предположению Р. Аквоу [10], СБ38 принадлежит ключевая роль в регуляции уровня внутриклеточного НАД+, однако, вероятно, в клетках головного мозга суммарная НАД+-глико-гидролазная активность определяется дополнительно другим ферментом. Неоднозначными остаются данные о том, насколько меняется уровень внутриклеточного НАД+ при ишемии мозга. Так, по данным [11], концентрация НАД+ в клетках головного мозга практически не меняется при ишемии. Показано, что церебральная ишемия не влияет на уровень НАД+ в зоне ишемии и пенум-бры, однако применение никотинамида как субстратного ингибитора НАД+-конвертирующих ферментов приводит к увеличению уровня НАД+ в клетках [12].
Данные о вкладе СБ38 в повреждение тканей при гипоксии и ишемии также противоречивы. Так, показано, что в гладкомышечных клетках аккумуляция НАДН в цитозоле при гипоксии приводит к торможению цАДФР-гидролазной активности СБ38, что вызывает накопление циклической АДФ-рибозы и интенсификацию механизма высвобождения кальция из внутриклеточных депо [13]. Аналогичные наблюдения были сделаны в клетках миокарда [14]. Вместе с тем, по данным 2.Б. ве [15], 30-минутная ишемия миокарда сопровождается снижением концентрации циклической АДФ-рибозы, а увеличенный уровень
НАДН напрямую тормозит высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума [16].
С учетом этого мы посчитали интересным изучить характер изменения внутриклеточной концентрации НАД+ в клетках головного мозга при гипоксически-ишемическом перинатальном поражении и оценить возможную роль CD38 в регуляции уровня НАД+ в физиологических и патологических условиях, что и явилось целью настоящей работы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на белых беспородных новорожденных детенышах крыс (n = 67).
Моделирование гипоксически-ишемического перинатального поражения головного мозга осуществлялось по методу J.Rice [17] на 7-е сут пост-натального развития: экстравазальная окклюзия правой общей сонной артерии с последующим помещением крысят в атмосферу с низким содержанием кислорода (8%) под общей анестезией кета-мином (25 мг/кг). Забор материала для исследования (головной мозг) производили через 8 часов, 72 ч и 10 сут после операции (7, 10 и 17 дни постна-тального развития, соответственно P7, P10, P17). Образцы ткани головного мозга, полученные от животных после декапитации, использовались для приготовления замороженных фиксированных тонких срезов (до 3 цм толщиной) и гомогенатов для последующего иммуногистохимического и спектрофлуориметрического анализов, соответственно. Для исследования использовалось ипси-латеральное полушарие, с учетом данных J. Rice [17] и наших данных [18] о том, что признаки ише-мического поражения головного мозга развиваются в ипсилатеральном, но не в контрлатеральном полушарии. Контрольную группу составили лож-нооперированные животные (n = 19), на соответствующих этапах постнатального развития, не подвергающиеся воздействию ишемии или гипоксии, для адекватной интерпретации данных о влиянии суммарного гипоксически-ишемического повреждения на клетки головного мозга животных экспериментальных групп (n = 12 в каждой группе). Все исследования проводились с соблюдением правил гуманного обращения с животными.
Оценка ферментативной активности АДФ-рибозилциклазы/СйЗв осуществлялась флуори-метрическим методом с использованием флуоро-генного субстрата - никотинамидгуаниндинуклео-тида (НГД) согласно стандартному протоколу. Гомогенизация образцов ткани осуществлялась при 4°С, в полученном гомогенате определялась концентрация белка по стандартному протоколу (Mic-
roLowry test, Sigma, США) и активность фермента путем инкубации 100 мкл гомогената ткани с реакционной смесью, содержащей 100 мкмоль НГД в 20 мМ трис-HCl (рН 7.4) в течение 20 мин при 37°С. Регистрация флуоресценции супернатанта осуществлялась на 0 и 20 мин инкубации на спектро-флуориметре СМ2203 (Solar, Belarus) при длине волны возбуждения 300 нм и длине волны испускания 410 нм. Активность фермента вычислялась по разнице амплитуды флуоресценции на 20 и 0 минутах инкубации, отнесенной к мг белка ткани в минуту.
Для оценки уровня внутриклеточного НАД+ в гомогенатах ткани мозга использован метод [19], при этом реакционная смесь содержала 0.08 мг тиазолила синего, 0.3 мг феназина метасульфа-та, 0.25 мг алкогольдегидрогеназы, 0.065 М гли-цилглицинового буфера, 0.065 М никотинамида, 0.33 мМ этанола, 0.1 мл гомогената ткани при рН 7.4. Реакция останавливалась через 30 мин инкубации при + 37°С, результат реакции оценивался спектрофотометрически при 556 нм и выражался в нМ НАД + на 1 мг ткани.
Для регистрации апоптоза нейронов головного мозга использовался метод TUNEL (Apoptag Direct Detection kit, Immunotech, France) согласно протоколу производителя. В частности, срезы ткани головного мозга фиксировались в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 20 мин, отмывались фосфатным буферным раствором (рН 7.4), после чего инкубировались с компонентами реакционной смеси, включая TdT и меченые FITC нуклеотиды. Для детекции ядерного материала срезы докрашивались иодидом пропидия. Участки специфической межнуклеосомной фрагментации ДНК, соответствующие местам включения меченых нуклеотидов в цепочку ДНК, регистрировались при микроско
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.