ш
УДК 577.22.112
НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА КВАНТОВЫХ ТОЧЕК К HER2-ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ ОПУХОЛИ С ПОМОЩЬЮ
РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ1 © 2015 г. И. В. Балалаева*, #, Т. А. Здобнова*, Е. А. Соколова*, С. М. Деев*, **
*Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23 **ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Поступила в редакцию 02.04.2015 г. Принята к печати 15.05.2015 г.
Продемонстрирована направленная доставка полупроводниковых квантовых точек (КТ) в организме иммунодефицитных лабораторных животных к экспериментальной опухоли молочной железы человека, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2. Для получения направленных комплексов КТ использована пара адаптерных белков, рибонкулеаза барназа и ее ингибитор барстар. Специфическое связывание с онкомаркером-мишенью обеспечено за счет бивалентного рекомбинантного белка, содержащего пептидные последовательности двух молекул одноцепочечного вариабельного фрагмента анти-HER2 антитела 4D5 (4D5scFv) и одной молекулы барназы. КТ конъюгировали с барстаром, итоговая сборка направленных комплексов осуществлялась за счет нековалентного специфического взаимодействия барстара в составе конъюгатов с КТ и барназы в составе направляющего рекомбинантного белка. Показанная нами доставка КТ к опухоли, экспрессирующей HER2, демонстрирует возможности и перспективы описанного подхода для направленной доставки нано-частиц к опухолевым клеткам in vivo с целью повышения эффективности диагностики, а также развития основанных на использовании наночастиц методов терапии.
Ключевые слова: квантовые точки, одноцепочечный вариабельный фрагмент анти-ИЕЯ2 антитела 4В5 (4D5scFv), онкомаркер ИЕК2, флуоресценция.
DOI: 10.7868/S0132342315050048
ВВЕДЕНИЕ
Фотолюминесцентные наночастицы различной природы находят все более широкое применение в оптической диагностике и терапии благодаря уникальному набору физико-химических свойств [1]. К таким свойствам наночастиц относятся: программируемость физических и химических характеристик в зависимости от размеров, состава и способов получения; наличие химически активных функциональных групп на поверх-
1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г
Сокращения: КТ — квантовые точки; PEG — полиэтилен-гликоль; Bn — барназа; Bs — барстар; HER2 — рецептор 2 к фактору роста эпидермиса человека (Human Epithelial growth factor Receptor 2); scFv — одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (single-chain variable fragment); PBS — натрий-фосфатный буфер (phosphate buffered saline), EDC — 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), ИПТГ — изопропил^^-1-тиогалактопиранозид. # Автор для связи (тел.: +7(831)462-32-13; факс: +7(831)462-32-02; эл. почта: irin-b@mail.ru).
ности, позволяющих модифицировать частицы, оптимизируя их для конкретной задачи; большая площадь поверхности, позволяющая присоединять значительное количество "модулей" с различными функциями, в том числе направляющих, терапевтических, визуализирующих.
Наиболее подробно изучены фотолюминесцентные частицы на основе полупроводниковых материалов, или квантовые точки (КТ). Среди привлекательных свойств этих наноматериалов необходимо отметить высокий квантовый выход фотолюминесценции, широкие спектры поглощения в сочетании с узкими спектрами эмиссии, исключительную фотостабильность и относительную легкость получения КТ с заданными оптическими свойствами [2]. КТ рассматриваются в качестве перспективных агентов в диагностике онкологических заболеваний для обнаружения и локализации опухолевых узлов и метастазов, оценки поражения регионарных лимфатических узлов и т.п. [3, 4].
Для придания способности избирательно маркировать опухолевые клетки и/или новообразо-
Рис. 1. Схема строения направленного комплекса КТ (KT-4D5scFv). КТ — квантовая точка; Bn — барназа; Bs — барстар; Vl, Vh — вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела 4D5 соответственно.
ванные сосуды опухолевой ткани КТ соединяют с направляющими модулями, специфически взаимодействующими с молекулярными мишенями (онкомаркерами) — молекулами на поверхности клеток, которые либо уникальны для опухоли данного типа, либо гиперэкспрессируются в опухолевой ткани, по сравнению с нормальной. В качестве направляющих модулей могут быть использованы, например, полноразмерные антитела [5], их фрагменты [6, 7], аффибоди [8, 9].
Перспективными для использования в качестве направляющего модуля считаются антитела формата scFv, представляющие собой единый полипептид, в котором вариабельные домены легких и тяжелых цепей иммуноглобулина соединены при помощи пептидного линкера [10]. Эти небольшие (25—30 кДа) молекулы легко нарабатываются в бактериальных продуцентах, стабильны в широком диапазоне параметров среды, сохраняют специфичность узнавания, присущую полноразмерному антителу, но лишены константных доменов, обусловливающих взаимодействие полноразмерных антител с клетками иммунной системы и белками комплемента и, как следствие, многочисленные побочные эффекты при их использовании in vivo.
Ранее нами были получены комплексы КТ с антителами 4D5scFv, узнающими клинически значимый онкомаркер HER2 и связывающимися с ним, и в эксперименте на клеточных культурах было продемонстрировано специфическое связывание таких комплексов с опухолевыми клет-
ками [11]. В данной работе мы исследовали доставку комплексов КТ к клеткам ксенографтной опухоли человека на иммунодефицитных мышах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для получения направленных комплексов КТ мы использовали разработанный ранее подход, основанный на использовании пары адаптерных белков: рибонкулеазы барназы (Bn) и ее ингибитора барстара (Bs) [12]. КТ конъюгировали с одним белком системы — Bs, в то время как антитело соединяли с другим белком системы — Bn. Для увеличения эффективности связывания с онкомар-кером-мишенью использовали бивалентный вариант рекомбинантного белка, содержащего пептидные последовательности двух молекул 4D5scFv и одной молекулы барназы (4D5scFv-Bn-4D5scFv) [13]. Итоговая сборка направленных комплексов осуществлялась за счет нековалентного специфического взаимодействия барстара в составе конъюга-тов с КТ и барназы в составе направляющего рекомбинантного белка (рис. 1).
Адаптерная система Bn-Bs является аналогом системы стрептавидин-биотин и позволяет осуществлять модульную сборку гибридных по составу многофункциональных комплексов за счет высокоаффинного взаимодействия (Kd~ 10-14 M), однако при использовании in vivo Bn-Bs обладает целым рядом преимуществ. Отсутствие аналогов этих белков в организме человека снижает уровень неспецифического взаимодействия с тканями, что характерно, например, для биотина, являющегося природным кофактором ряда ферментов. Неспецифическое взаимодействие препятствует использованию агентов, включающих биотин, для направленной доставки in vivo. Кроме того, белки Bn-Bs обладают существенно меньшим размером (12 и 10 кДа соответственно) по сравнению со стрептавидином (52.8 кДа), что предполагает и меньшую иммуно-генность за счет снижения числа антигенных детерминант. Немаловажен также тот факт, что белковая природа обоих компонентов пары Bn-Bs обеспечивает возможность генетических манипуляций.
Через 3 ч после внутривенного введения направленных комплексов КТ ^^4D5scFv) животным, носителям опухоли человека SKBR-3 с гиперэкспрессией рецептора HER2, комплексы были зарегистрированы в периферической области опухоли (рис. 2а). Характер распределения флуоресценции позволяет говорить о локализации КT-4D5scFv преимущественно в кровеносных сосудах или в непосредственной близости от них. Через 21 ч КT-4D5scFv были зарегистрированы в значительном количестве и в глубине опухолевого узла, при этом четкой солокализации с сосудами не прослеживалось. Сигнал флуоресценции в опухоли увеличивался в 2—2.5 раза по сравнению с
А
KT-4D5scFv
КТ-PEG Б Опухоль
\ " \aPNi /
/ V X
• * у ' /
* , \
*отн
3 г
Время, ч
I | KT-4D5scFv УЛ KT-PEG
21
Рис. 2. Анализ накопления в опухоли 8КБК-3 направленных и биоинертных КТ. А. Изображения опухолевой ткани экспериментальных животных, полученные методом конфокальной микроскопии через различное время после внутривенного введения направленного комплекса КТ-4В58сРу (слева) и биоинертных КТ-РЕО (справа) в дозе 0.14 нмоль на животное. Хех 488 нм, Хет 660—710 нм. Размер изображения 110 х 110 мкм. Наночастицы обозначены стрелками. а — Срезы периферического слоя опухолевого узла через 3 ч после введения; б — срезы глубокого слоя опухолевого узла через 21 ч после введения. Б. Интенсивность флуоресцентного сигнала в опухолевой ткани по отношению к сигналу в мышце через различное время после внутривенного введения направленного комплекса КТ-4В58сРу (серые столбцы) и биоинертных КТ-РЕО (заштрихованные столбцы).
мышечной тканью (рис. 2б). Значительная величина разброса количественных данных через 3 ч после инъекции отражает гетерогенность распределения КТ в пределах опухолевого узла для всех проанализированных образцов.
Для сравнения, биоинертные КТ, покрытые полиэтил енгликол ем (КТ-PEG), практически не были обнаружены в опухолевой ткани (рис. 2). В первые часы после введения некоторое количество КТ-PEG было локализовано в периферических сосудах опухолевого узла, тогда как через сутки после введения были отмечены лишь единичные точечные участки с флуоресценцией, соответствующей КТ
Хорошо известен эффект повышенного накопления и удержания в опухолевой ткани частиц нанометрового размера, обусловленный особенностями строения кровеносного русла опухоли и отсутствием адекватного лимфатического дренирования. В англоязычной литературе эта особенность получила название EPR-эффекта (от англ. "enhanced permeation and retention") и используется для доставки в опухоль липосом, полимерных микросфер и т.п. [14]. Тем не менее, значимого накопления в опухоли КТ-PEG, лишенных направляющего модуля, в отличие от КT-4D5scFv, мы не набл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.