ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152
НАРУШЕНИЕ БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА - РАННЕЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ АМИЛОИДА-р В НЕЙРОНАХ
© 2012 г. Р. Я. Гордон1, *, Е. Г. Макарова2, И. Я. Подольский2, В. В. Рогачевский1, О. Л. Кордонец2
Институт биофизики клетки РАН 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Амилоидные в-пептиды (Ав) играют ключевую роль в развитии болезни Альцгеймера (БА). Ответ нейронов на введение Ав в экспериментальных моделях БА на животных остается недостаточно исследованным. Изучено раннее проявление действия Ав25-35 в нейронах поля CA1 гиппокампа после интраветрикулярного и интрагиппокампального введения. В работе использовали различные методы микроскопии: световую в сочетании с иммуногистохимией, флуоресцентную и электронную. Соотношение красной и зеленой флуоресценции (Ка) после окрашивания клеток акридиновым оранжевым (AO) отражает состояние rRNA в рибосомах и коррелирует с долей активных полирибосом в общем количестве рибосом в цитоплазме, что позволяет оценить интенсивность синтеза белка. В первый день после интрагиппокампального воздействия Ав25-35 значение Ка снизилось до 55% в морфологически неповрежденных нейронах. Через 14 дней в основной массе нейронов наблюдались признаки дегенерации и наличие депозитов Ав. На 14-й день после интравентрикулярного введения значение Ка снизилось до 35% от контроля в морфологически неповрежденных нейронах. Депозитиы Ав не были обнаружены в них. Ультраструктурный анализ цитоплазмы выявил существенное увеличение количества тяжелых полирибосом, что, вероятно, является причиной снижения величины Ка. Таким образом, ранним проявлением действия Ав на пирамидные нейроны поля СА1 является нарушение синтеза белка в результате формирования в цитоплазме повышенного количества тяжелых полирибосом. Последующее развитие дегенерации нейронов, по-видимому, является результатом накопления в цитоплазме эндогенного Ав.
Ключевые слова: амилоид-в, болезнь Альцгеймера, пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа, синтез белка, полирибосомы, нейродегенерация.
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Альцгеймера (БА) — серьезное нейро-дегенеративное нарушение, сопровождающееся прогрессивным снижением памяти и слабоумием. Амилоидные р-пептиды (Ар) играют значительную роль в патогенезе БА [1—5].
Многочисленные косвенные исследования показали, что БА сопровождается нарушением белкового синтеза [6—11]. Манн с соавторами выявил значительное повреждение белкового синтеза в нейронах мозга на разных стадиях БА по таким показателям, как содержание цитоплазматической РНК, объемы ядер и ядрышек [12]. Динг с соавторами показали, что снижение скорости и интенсивности белкового синтеза ассоциирует с нарушением функции рибосом. Авторы связывают такие изменения с ранней стадией БА [13].
Поскольку снижение белкового синтеза наблюдается в областях мозга, регулирующих когнитивную функцию (гиппокамп и фронтальная кора)
*Адресат для корреспонденции: 142290, Пущино, Московская область, ул. Институтская, 3; тел.: +7 (916) 233-14-16; факс: +7 (4967) 33-05-09; e-mail: ritagordon@yandex.ru.
[13], исследование этих структур представляет особый интерес.
Экспериментальные модели БА на животных позволяют исследовать ранний токсический эффект Ар на когнитивные процессы и морфологическое состояние нейронов [14—22]. После интравентрикулярного введения Ар может оказывать воздействие на разные структуры мозга, в том числе и на гиппокамп [15—19]. После интрагиппокампального введения Ар действует непосредственно на гиппокамп [20, 21]. Существуют противоречивые данные о действии Ар на когнитивные процессы и состояние нейронов при этих введениях [15, 16, 20—23]. Проведение сравнительного анализа различных методов центрального введения Ар позволит внести ясность в этот вопрос.
Методом флуоресцентной микроскопии с акридиновым оранжевым (АО) исследовалось состояние цитоплазматической рРНК в индивидуальных пирамидных нейронах поля СА1 дорзального гиппокампа крыс на ранней стадии центрального введения агрегированного Ар. Отношение интен-сивностей красной и зеленой флуоресценции (ко-
139
4*
эффициент Ka) отражает состояние рРНК в рибосомах и позволяет оценить интенсивность белкового синтеза в каждой отдельной клетке. Подробное обоснование методики дано в предшествующей работе [24]. Белковый синтез может снижаться как при диссоциации рибосом, так и при формировании превалирующего количества тяжелых полирибосом. Для выяснения этого явления использовали электронную микроскопию. Для выявления признаков нейродегенерации использовали световую микроскопию (окраска крезиловым фиолетовым), идентификацию депозитов Ар определяли имму-ногистохимическим методом.
Для исследования прямого действия Ар на нейроны была использована модель переживающих срезов гиппокампа, в которых контролировалась электрическая активность нейронов [25].
Показано, что ранним проявлением действия Ap in vivo является нарушение белкового синтеза в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа. Причиной такого эффекта является формирование превалирующего количества тяжелых полирибосом. В дальнейшем развивающаяся дегенерация нейронов, вероятно, является результатом накопления в цитоплазме эндогенного Ар.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на 87 крысах — самцах Вистар (3 мес.), выращенных в стандартных условиях в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН со свободным доступом к пище и воде при естественном световом режиме. Эксперименты осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕС) и одобренных комитетом по медицинской этике ИТЭБ РАН в соответствии с положением о работе с экспериментальными животными.
Вещества и способ введения. Ар25-35 ("Sigma", USA) растворяли в дистиллированной воде и агрегировали в течение 24 ч при температуре 37°С. Уровень агрегации р-амилоида определяли с помощью электронного микроскопа по наличию фибриллярных агрегатов после негативного контрастирования водным раствором уранилацетата. Контрольным животным вводили 0.9% раствор NaCl. Операции осуществляли в стереотаксиче-ском аппарате в стерильных условиях под комбинированным наркозом золетила ("Verbae sante animale", France) 12 мг/кг и ксилазина ("Bioveta", Czechia) 20 мг/кг. Вещества вводили однократно билатерально по следующим координатам: (1) боковые желудочки мозга АР = —0.8 mm; L = 1.5 mm; Н = 3 mm (n = 24, где n — число животных), (2) поле СА1 гиппокампа, АР = 4 мм; L = 3 мм; Н = 3 мм [Paxinos, 1982] с помощью микрошприца Гамильтона ("Hamilton", Germany, 5 мкл) в следующих
концентрациях: Ар25—35 1.6 нмоль/1 мкл, 0.9% раствор NaCl в концентрации 15 мкл/желудочек или 1 мкл/гиппокамп. Локализация места введения веществ осуществлялась на парафиновых срезах гиппокампа (40 мкм), окрашенных крезиловым фиолетовым.
Морфологические и гистохимические исследования были проведены после интрагиппокампаль-ного введения на 1-й и 14-й день: (1) интактный контроль, n — 6, (n — число животных); (2) введение 0.9% раствора NaCl, n — 6; (3) введение Ар25—35, n — 6; а после интравентрикулярного введения на 14-й и 30-й день: (1) интактный контроль, n — 9; (2) введение 0.9% раствора NaCl, n — 9; (3) введение Ар25
-35, n — 9.
Переживающие срезы гиппокампа. Эксперименты выполнены на гиппокампальных срезах крыс толщиной 300 мкм, n — 12. Регистрацию популя-ционных спайков от пирамидных нейронов поля СА1 вызвали электрической стимуляцией колла-тералей Шафера и начинали через 2 ч 40 мин после начала эксперимента по ранее описанной методике [27]. Контролем служили срезы, помещенные в перфузионную среду (раствор Кребса-Рингера на бикарбонатном буфере), n — 6 (n — число животных). В опыте в перфузионную среду вводили Ар25—35 в концентрации 260 нМ [28], n — 6. Длительность перфузии для каждого вещества составляла 20 мин.
Приготовление образцов ткани. После декапи-тации часть мозгов и часть переживающих срезов фиксировали в жидкости Карнуа (этанол — хлороформ — уксусная кислота 6 : 3 : 1 соответственно), а другую часть фиксировали в 4% формальдегиде на фосфатном буфере. После обезвоживания объекты помещали в парафин. Из блоков изготовляли срезы толщиной 7 мкм (микротом Leica, Germany). Срезы использовали для световой, флуоресцентной микроскопии и иммуногистохимии.
Флуоресцентная микроскопия. Для исследования состояния РНК в цитоплазме нейронов был использован метод окрашивания АО (Fluka Chemia AG, Buchs, Switzerland) в условиях оптимальных для взаимодействия красителя с РНК. После депарафинирования и регидратации срезы промывали в цитратно-фосфатном буфере, рН 4.2 в течение 4 мин, окрашивали АО в концентрации 3 х 10-4 М на том же буфере в течение 10 мин по методике, описанной ранее [24].
Мономеры АО образуют комплексы с двуните-выми участками РНК, которые флуоресцируют в области 530 нм (/530), а находящиеся в растворе ди-меры АО связываются с однотяжевыми участками РНК и флуоресцируют в области 640 нм (I640). Измерения флуоресценции проводили на микро-спектрофлуориметре ДМФ-2 в цитоплазме нейронов с помощью регистрирующего зонда (6.5 мкм в диаметре) при увеличении х85 [11]. Измерения и
обработку данных выполняли с использованием оригинальной программы Microfluor (Россия). Исследовали по 100 пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа для каждого животного.
Для анализа цитоплазмы использовался коэффициент Ka = (1б4о)/(15зо), представляющий собой отношение интенсивностей красной и зеленой флуоресценции.
Поскольку рРНК составляет более 80% от всей цитоплазматической РНК, то Ka отражает состояние рРНК в рибосомах. В отдельной работе ранее сопоставляли Ka и особенности ультраструктуры в нейронах с различным уровнем функциональной активности и разным содержанием в цитоплазме активных полирибосом [24]. Было показано, что в тех нейронах, в которых основная масса полирибосом диссоциирована, величина Ka низка, Ka повышается по мере увеличения активно функционирующих полирибосом. На культуре клеток ней-робластомы при обработке циклогексимидом (ингибитором белкового синтеза) сравнивали флуоресцирование АО и включение меченых аминокислот, от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.