РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 1, с. 28-33
^ ОБЩАЯ
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 581.1:539.1.047
НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИИ АКВАПОРИНОВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН КАК ПРИЧИНА ИЗМЕНЕНИЯ ВСХОЖЕСТИ СЕМЯН ГОРОХА ПРИ ДЕЙСТВИИ g-ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ
© 2007 г. В. А. Веселовский, Т. В. Веселова*
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва
Семена гороха (Pisum sativum L.) из партии с 80%-иой всхожестью по уровню фосфоресценции при комнатной температуре делили на фракции I (сильные семена) и II (ослабленные семена). При проращивании семена фракции II набухали вдвое быстрее остальных и испытывали гипоксию. В результате одна часть их не прорастала, а другая - производила ненормальные проростки (тоже невсхожие). Через неделю после воздействия у-излучения в дозе 3 Гр на семена гороха всхожесть неразделенной их партии понижалась до 45% за счет возрастания доли ослабленных семян фракции II. Всхожесть семян, облученных в дозах 7 и 10 Гр, мало отличалась от контрольных семян. В партии появлялись так называемые улучшенные семена, которые по уровню фосфоресценции, всхожести и скорости поглощения воды при набухании были похожи на семена фракции I. Разная скорость набухания семян, как показали опыты с парахлормеркуриобензоатом, зависела от проницаемости клеточных мембран, определяемой состоянием аквапоринов ("открыт" - "закрыт"). Опыты с ингибитором фосфатазы (NaF) показали, что у семян, облученных в дозе 3 Гр (фракция II), механизм закрывания аквапориновых каналов при набухании нарушен, вероятно, из-за того, что фосфатаза не активируется при гидратации семени. У воздушно-сухих семян, улучшенных облучением в дозе 10 Гр, водные мембранные каналы необратимо закрывались до набухания семян. Для объяснения увеличения всхожести семян гороха (бобовых) после начального ее понижения (гормезис) в результате облучения в малых дозах, по-видимому, не нужно использовать гипотезу о гиперфункции восстанавливающих механизмов при набухании семян. Изменение качества семян (переход из одной фракции в другую) наблюдается в воздушно-сухом их состоянии.
Семена гороха, всхожесть, у-излучение, малые дозы, фосфоресценция при комнатной температуре, фракции семян разного качества, аквапорины, водные каналы, (п-)парахлормеркуриобензоат, дитиотрейтол, NaF, фосфоресценция порфиринов.
Ранее мы показали, что всхожесть семян гороха в ходе ускоренного старения (температура 40°С, 85%-ная относительная влажность воздуха) [1] и облучения [2] изменяется парадоксальным образом: сначала падает, затем с увеличением дозы воздействия восстанавливается практически до исходного уровня и, наконец, необратимо уменьшается. Колебание всхожести семян определялось изменением фракционного состава партий семян. В основе деления партий воздушно-сухих семян на фракции лежал уровень их фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ). Сильные всхожие семена с низким уровнем свечения составляли фракцию I. Живые семена более низкого качества составляли фракцию II с уровнем свечения в 1.5-2 раза более высоким. Они набухали вдвое быстрее семян фракции I, что приводило к развитию гипоксии, которая была причи-
*Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, Биологический ф-т Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; тел.: (495) 939-32-73; факс: (495) 939-1115; e-mail: taveselova@yandex.ru.
ной появления проростков с морфологическими дефектами [3, 4]. Появление семян фракции II понижало всхожесть неразделенной их партии, а уменьшение размеров этой фракции, напротив, увеличивало всхожесть.
Вода поступает в растительную клетку через липидный бислой мембран и по водным каналам, которые формируют трансмембранные белки аквапорины. Скорость транспорта воды в клетку по водным каналам в десятки раз быстрее, чем при диффузии через липидный бислой [5, 6]. Аквапорины у семян составляют 5-10% от общего количества мембранных белков [7, 8]. Они синтезируются на поздних стадиях созревания семени и регулируют его набухание [9-11]. Скорость поступления воды в клетку по водным каналам определяет их количество и состояние ("открыт" - "закрыт"), которое регулирует Са2+-зависимая киназно-фосфатазная система клетки. В фосфорилированном состоянии каналы "открыты" и "закрываются" при де-фосфорилировании аквапоринов [5, 7, 10, 12, 13].
Проницаемость липидного бислоя для воды зависит от его физического состояния, которое определяет жирно-кислотный состав мембран. При хранении (старении) и после разных воздействий в результате свободнорадикального окисления липидный состав мембран у воздушно-сухих семян изменяется. В жидкокристаллической структуре мембраны появляется гелевая фаза, нарушающая взаимодействие мембранных белков и липидов. При набухании между гелеобраз-ными доменами бислоя происходит утечка ионов и других низкомолекулярных продуктов. Таким образом, состояние липидного бислоя становится определяющим фактором проницаемости мембран на стадии гибели поврежденных клеток семени [14, 15].
Мы установили, что всхожесть партии облученных семян гороха зависит от их соотношения во фракциях I и II (медленно и быстро набухающих семян) [2]. В данной работе мы попытались оценить роль аквапоринов в набухании семян после облучения в малых дозах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили семена гороха Pisum sativum L. (сорт Немчиновский-85 урожая 2002 г.) с 80%-ной всхожестью. Для опытов отбирали внешне неповрежденные семена, близкие по размеру и весу (180 ± 20 мг). Семена гороха подвергали воздействию у-излучения на установке "ROKUS-M" при мощности дозы 0.913 Гр/мин на расстоянии 75 см от источника. Дозу подбирали, варьируя время облучения. Облучение проводили в ОИЯИ (г. Дубна) в малых дозах (3, 7 и 10 Гр), которые, по данным литературы, увеличивают прорастаемость семян и стимулируют жизнедеятельность растений, инициируя феномен радиационного гормезиса [16]. Оценивали состояние аквапоринов в период от 6-х по 20-е сут после облучения. В этот период изменение распределения воздушно-сухих семян по уровню ФКТ было незначительным (в пределах ошибки опыта).
О проницаемости мембран семян для воды судили по скорости увеличения веса семян в динамике набухания. Семена набухали в чашках Петри (диаметром 6 см) между двумя слоями фильтровальной бумаги. В каждую чашку с десятью семенами наливали по 4 мл H2O с последующим восполнением ее по мере поглощения. Семена погружали в воду на 1-2 мм. Каждое семя взвешивали через 0, 2, 4, 6, 18 и 22 ч от начала набухания. Изменение веса рассчитывали в процентах от исходных его значений. После 20 ч набухания проращивание продолжали в рулонах фильтровальной бумаги.
Чтобы блокировать аквапорины и закрыть водные каналы в клетках некоторых семян, их набухание проводили в 5 мкмоль/л растворе (я-)парахлормеркуриобензоата (ПХМБ) ("Sigma", США). Для обращения действия ПХМБ семена отмывали в 1 ммоль/л растворе дитиотрей-тола (ДТТ, "Reanal", Венгрия) [5].
Для ингибирования активности фермента фос-фатазы, который участвует в дефосфорилировании аквапоринов и закрывании каналов, набухание семян проводили в растворе фторида натрия [17, с. 119]. Действующую концентрацию ингибитора подбирали экспериментально (10-1000 мкмоль/л).
Регистрацию фосфоресценции воздушно-сухих и набухших семян при комнатной температуре проводили на установке, описанной ранее [18]. Не содержащие свободную воду воздушно-сухие семена и биопрепараты фосфоресцируют при комнатной температуре. Поэтому регистрируя свечение индивидуальных семян, можно строить график их распределения по этому показателю и делить партию семян на фракции.
При набухании семян гороха (10-12 ч) у некоторых из них под оболочкой (около зародыша) возникает дефицит кислорода (гипоксическое состояние). У таких семян регистрировали фосфоресценцию эндогенных порфиринов [3].
Всхожесть семян гороха определяли согласно международным правилам оценки всхожести по числу нормальных проростков после 5 сут проращивания [19]. Проростки с морфологическими дефектами и нарушениями роста считали ненормальными, а семена невсхожими. Семена, которые имели высокий уровень фосфоресценции эндогенных порфиринов, "задыхались" и не наклевывались, считали живыми, но невсхожими [4]. Мертвые семена не наклевывались в течение 5 сут и не фосфоресцировали, так как не дышали.
Опыты проводили в 3-5-кратной повторности. В таблице приведены средние арифметические значения величин показателей и их стандартные ошибки. Достоверность разницы по всхожести семян оценивали по критерию Фишера, а о достоверности разницы в скорости набухания судили по критерию расхождения распределений X Колмогорова-Смирнова [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Распределения воздушно-сухих семян гороха по уровню ФКТ показаны на рис. 1. Видно, что распределение по этому показателю необлучен-ных семян имеет один максимум при 40 отн. ед. и небольшое плечо справа (кривая 1). Через неделю после облучения в дозе 3 Гр в распределении семян кроме указанного максимума при 40 отн. ед. появляется новый максимум при 60 отн. ед., т.е. возрастает число семян во фракции II (кривая 2).
30 ВЕСЕЛОВСКИИ, ВЕСЕЛОВА
Влияние NaF на набухание и всхожесть семян гороха фракции I
Показатели Концентрация NaF, мкмоль/л
0 10 100 1000
Увеличение веса семян после 22 ч набухания, % от исходного Всхожесть (число нормальных проростков), % 70 ± 6 98 ± 4 (81 ± 5)** (88 ± 4)* (89 ± 6)** (54 ± 6)** (90 ± 8)** (36 ± 8)**
Примечание. Для эксперимента из партии 80%-ной всхожести были отобраны семена с уровнем ФКТ 40 ± 5 отн. ед. (фракция I). * Отличие от контроля достоверно, р = 0.95; ** то же, р = 0.999.
Распределение семян, облученных в дозе 10 Гр (кривая 3), вновь имеет только один максимум при 40 отн. ед. и небольшое плечо.
Для дальнейших экспериментов по уровню ФКТ были отобраны семена разного качества: 1) необлученные семена фракции I (уровень ФКТ 40 ± 5 отн. ед.); 2) семена фракции II (уровень ФКТ 60 ± 5 отн. ед) из партии, облученной в дозе 3 Гр, и 3) семена, облученные в дозе 10 Гр, с уровнем ФКТ 40 ± 5 отн. ед., дававших нормальные проростки. Такие облученные семена наз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.