ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 432, № 5, с. 705-707
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.634
НАРУШЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ГОРМОНАМИ ИНСУЛИНОВОГО СЕМЕЙСТВА NO-СИНТАЗНОЙ СИСТЕМЫ В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС НА СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОЙ МОДЕЛИ НЕОНАТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА ВТОРОГО ТИПА
© 2010 г. Л. А. Кузнецова, О. В. Чистякова, В. М. Бондарева, Т. С. Шарова, М. Н. Перцева
Представлено академиком В.Л. Свидерским 24.11.2009 г. Поступило 11.12.2009 г.
В последние годы изучение роли оксида азота (N0) в клеточной сигнализации становится одной из наиболее развивающихся областей биологии и медицины. N0 — липофильная молекула, содержит непарный электрон, обеспечивающий ее химическую активность в качестве свободного радикала с коротким периодом жизни [1]. Являясь внутриклеточным посредником гормонального действия, N0 регулирует целый ряд биологических процессов [2]. N0-синтазы (КФ 1.14.13.39) — семейство ферментов, катализирующих окисление Х-аргинина до N0 и Х-цитрулина. Три изофор-мы N0-синтаз обнаружены во многих тканях, в том числе и в мышцах [1]. Две конститутивные изофор-мы — эндотелиальная и нейрональная, постоянно присутствуют в клетке, а их активация стимулирует цитозольную форму гуанилатциклазы— фермента, синтезирующего циклический гуанозин-монофосфат [3].Третья изоформа — индуцибель-ная, участвует в реализации функций цитокинов и в иммунных реакциях. Основное внимание уделяется изучению фермента в сердце и эндотелии сосудов. Показано, что фосфорилирование рецептора инсулина при действии гормона активирует эндотелиальную N0-синтазу в сердце млекопитающих [3]. Этот эффект инсулина в сердечной мышце реализуется через следующую сигнальную цепь: рецептор тирозинкиназа ^ инсулинрецепторный субстрат 1 ^ фосфатидилинозитол 3-киназа ^ ^ протеинкиназа Д1 ^ протеинкиназа В ^ эндотелиальная N0-синтаза. Данные по регуляции N0-синтазы при сахарном диабете немногочисленны. В скелетных мышцах крысы при стрепто-зотоциновом диабете 1-го типа активность N0-синтазы падает, что связано со снижением содержания белка нейрональной и эндотелиальной
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
изоформ [4]. При сахарном диабете 2-го типа в мышцах человека снижается как активность NO-синтазы, так и ее стимуляция инсулином [5].
Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния пептидов инсулинового семейства: инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и релаксина, а также взятого для сравнения бета-адрененергического агониста изопроте-ренола — синтетического аналога адреналина на активность NO-синтазы в скелетных мышцах нормальных и диабетических крыс. Согласно развиваемой авторами концепции молекулярные дефекты, возникающие в гормональных сигнальных системах, являются ключевыми причинами эндокринных заболеваний [6]. Исходя из этих представлений, в работе осуществлен поиск функциональных нарушений в действии вышеуказанных гормонов на NO-синтазную систему при инсулиннезависимом диабете 2-го типа.
Неонатальную стрептозотоциновую модель сахарного диабета 2-го типа получали на крысах (самцах) линии Wistar. Двухдневным крысятам вводили внутрибрюшинно 85 мг/кг стрептозото-цина. Исследования проводили на 80-е и 180-е сутки развития диабета. Перед экспериментом крыс тестировали на толерантность к глюкозе, отбирая животных с гипергликемией. Изучали как общую активность NO-синтазы, так и активность ее конститутивных изоформ. Для идентификации эндотелиальной и нейрональной NO-синтаз использовали антитела ("Sigma", США), специфичные к 1185—1205 и 251—270 аминокислотным остаткам изоформ фермента соответственно. Антитела (в разведении 1 : 1000) инкубировали с гомогенатом скелетных мышц (m. gastrocnemius) при комнатной температуре за 15 мин до действия гормонов. Влияние пептидов инсулино-вой природы (10-9 М) и изопротеренола (10-6 М) на активность NO-синтаз изучали in vitro, добавляя агенты к гомогенату на 30 мин при комнатной температуре. Активность NO-синтаз определяли
706
КУЗНЕЦОВА и др.
Рис. 1. Активность МО-синтаз в скелетных мышцах контрольных и диабетических крыс. 1 — общая активность фермента; 2 — активность фермента при действии антител к нейрональной МО-синтазе; 3 — активность фермента при действии антител к эндотелиальной МО-синтазе. а — без влияния, б — инсулин, 10-9 М, в — ИФР-1, 10-9 М, г — релаксин, 10-9 М, д — изопротеренол, 10 6 М. Решеткой отмечено достоверное влияние антител на активность фермента. Звездочкой отмечено достоверное влияние пептидов и изопротеренола на активность фермента прир < 0.05.
в мембранной фракции спектрофотометриче-ским методом [7, 8] и выражали в мкмоль НАДФ за минуту на 1 мг мембранного белка.
Показано, что в скелетных мышцах контрольных и диабетических крыс общая активность N0-синтазы представлена в мембранно-связанной форме. Пептиды инсулинового семейства и изопротеренол сходно стимулировали общую активность фермента у контрольных животных (рис. 1). В литературе имеются сведения о способности гормонов инсулиновой природы влиять на активность МО-синтазы [9—11]. В частности, в культуре клеток, похожих на остеобласты крыс, инсулин и ИФР-1 стимулировали МО-синтазу, причем действие инсулина было более выражено [9]. У контрольных животных активности нейрональной и эндотелиальной МО-синтаз от общей активности фермента составляли 30—35 и 15% соответственно, что согласуется с данными других авторов [12]. Антитела к нейрональной изоформе снимали стимулирующие эффекты пептидов и изопротеренола, из чего следует, что нейрональ-ная МО-синтаза является мишенью для действия изученных пептидов и изопротеренола. Антитела к эндотелиальной МО-синтазе блокировали эффект инсулина, релаксина и изопротеренола, но не ИФР-1, что указывает на нечувствительность данной изоформы к действию ИФР-1.
На 80-е и 180-е сутки развития диабета общая активность МО-синтазы в мышцах крыс снижалась на 20—30% по сравнению с контролем, а стимулирующее влияние пептидов и изопротеренола
сильно ослабевало или отсутствовало (рис. 1), что согласуется с данными литературы [13]. Антитела к нейрональной изоформе дополнительно усиливали блокаду стимулирующего эффекта гормонов. Антитела к эндотелиальной изоформе подавляли (и особенно сильно на 180-е сутки диабета) влияние инсулина, релаксина и изопротеренола, тогда как эффект ИФР-1 сохранялся, что было показано и для нормы. Таким образом, выявленное при неонатальном диабете 2-го типа у крыс снижение активности МО-синтазы и нарушение ее регуляции пептидами инсулиновой природы и изопротеренолом связано с утратой чувствительности к этим гормонам конститутивных изоформ фермента.
Таким образом, в работе впервые показано, что инсулин, ИФР-1, релаксин и изопротеренол стимулируют МО-синтазы в скелетных мышцах крыс. Сделан вывод, что при экспериментальном диабете 2-го типа в мышцах крыс снижается активность конститутивных изоформ МО-синтазы и повреждается их регуляция пептидами инсули-новой природы и изопротеренолом, что может приводить к нарушению процессов, зависимых от МО. Полученные данные вносят вклад в выяснение роли пептидов инсулиновой природы в регуляции МО-синтазной сигнальной системы и раскрывают функциональные нарушения в этой системе при диабете 2-го типа, что имеет как теоретическое, так и практическое значение.
НАРУШЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ГОРМОНАМИ ИНСУЛИНОВОГО СЕМЕЙСТВА
707
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Stamler J.S., Meissner G. // Physiol. Rev. 2001. V. 81. № 1. P. 210-231.
2. Murad F. // Biosci. Rep. 2004. V 24. № 4/5. P. 452474.
3. Muniyappa R., Montagnani M., Kon Koh K., Quon M.J. // Endocrine Revs. 2007. V. 285. P. 463491.
4. Perreault M., Dombrowski L., Marette A. // Diabetolo-gia. 2000. V. 43. № 4. P. 427-437.
5. Kashyap S.R., Roman L.J., Lamont J. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. V. 90. № 2. P. 1100-1105.
6. Перцева М.Н., Шпаков А.О. // Рос. физиол. журн. 2004. Т. 90. № 8. Ч. 2. С. 446-447.
7. Plesneva S.A., Shpakov A.O., Kuznetsova L.A., Pertseva M.N. // Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. P. 1277-1291.
8. StuehrD.J., Griffith O.W. In: Methods in Nitric Oxide Research. L.: Wiley, 1996. 712 p.
9. Kim S.J., Chun J.Y., Kim M.S. // Biochem. and Bio-phys. Res. Communs. 2000. V. 278. № 3. P. 712-718.
10. Esberg L.B., Zhang X., Scott G.I. et al. // Comp. Biochem. and Physiol. 2004. V. 138. № 2. P. 141-146.
11. Kobzik L., Stringer B., Balligand J.L. et al. // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1995. V. 211. № 2. P. 375744.
12. Pollock J.S., Fôrstermann U., Tracey W.R.., Nakane M. // Histochem. J. 1995. V. 27. № 10. P. 738-744.
13. Young M.E., Leighton B. // Biochem. J. 1998. V. 329. P. 73-79.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.