НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 4, с. 287-293
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 615.27:612.82.015.3
НАРУШЕНИЕ ШАПЕРОННОИ АКТИВНОСТИ HSP-70 - ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ ФОРМИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
© 2011 г. И. Ф. Беленичев, Ю. М. Колесник, С. В. Павлов, Е. П. Соколик*, Н. В. Бухтиярова
Запорожский государственный медицинский университет
В статье исследована роль характера экспрессии HSP-70 и Hif16 в развитии патологических изменений в головном мозге экспериментальных животных в условиях ишемии. Установлены нейрон- и митопротективные свойства белка теплового шока HSP-70 и Hif16 in vitro и в условиях церебральной ишемии, реализуемые за счет стабилизации окислительно поврежденных макромолекул, ограничения нитрозативного и оксидативного стресса, а также прямого митопротективного действия, направленного на уменьшение проявлений митохондриальной дисфункции. Подобная роль этих белков обуславливает актуальность поиска новых нейропротективных лекарственных средств, способных обеспечить протекцию/модуляцию генов, кодирующих эти белки.
Ключевые слова: митохондриальная дисфункция, белки теплового шока, шапероны, ишемия.
Известно, что церебральная ишемия вызывает гибель клеток головного мозга и сопровождается активацией наборов генов, которые обеспечивают адаптацию клеток и тканей к низкому содержанию кислорода [1].
В последнее время рядом экспериментальных работ установлена активация в условиях ишемии генов, кодирующих синтез белка HIF-1 (hypoxia — inducible factor) и, особенно, его субъединицы ШП.б (120 кДа), который в условиях ишемии отвечает за экспрессию гена эритропоэтина и еще приблизительно 60 генов, продукты которых участвуют в таких процессах как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, стабилизация белковых молекул в условиях оксидативного стресса [2, 3]. Кроме того, в последнее время появились данные о роли белков теплового шока (HSP) в стабилизации ШАб при церебральной ишемии, сопровождающейся интенсификацией процессов свободнорадикаль-ного окисления, смещением тиол-дисульфидного равновесия, развитием нитрозативного стресса, глутаматной эксайтотоксичности [3, 4]. HSP индуцируются в клетках всех живых организмов в ответ на действие многочисленных стрессорных факторов, таких как тепловой шок, гипоксия, ишемия, метаболические нарушения, вирусная инфекция и воздействия фармакологических агентов. Гены этих белков активируются не только в условиях стресса, но и в ходе основных процессов клеточной жизнедеятельности, пролиферации, диффе-ренцировки и апоптоза [5]. HSP принимают уча-
*Адресат для корреспонденции: 69035, Украина, Запорожье, пр. Маяковского, 26, тел: (0612) 24-64-69, факс: (0612) 3360-07, e-mail: sokolikep@gmail.com.
стие во всех процессах жизнедеятельности тканей и органов. По-видимому, большинство защитных функций HSP связано с шаперонной активностью, т. е. с их способностью узнавать поврежденные или вновь синтезированные полипептиды и выправлять их структуру АТФ-опосредованным образом или удалять не поддающиеся исправлению белки через протеосомный аппарат. Было установлено, что один из шаперонов, белок HSP-90, способен связываться с доменом PAS В-фактора и стабилизировать его. Другой клеточный шаперон, HSP-70, узнает иной структурный мотив молекулы НИ1б, так называемый домен кислоро-дзависимой деградации (ODD) [6]. Следует отметить, что роль этих межбелковых взаимодействий неясна; предполагается, что они необходимы для стабилизации НИ1б в условиях нормоксии. В условиях гипоксии по крайней мере один из шаперо-нов (HSP-70) вытесняется из комплекса с НИ1б белком ARNT, который в течение 20—30 мин гипоксии предохраняет структуру фактора от прицельного протеолиза. Таким образом, можно предположить, что HSP-70 способен увеличивать время жизни фактора ШИб в условиях до и после гипоксии и, таким образом, необходим клеткам для надлежащей реакции на лишение кислорода [7].
В последнее время появились данные о регулирующем действии белков HSP на явления ми-тохондриальной дисфункции, развивающейся при ишемическом поражении головного мозга вследствие вышеперечисленных биохимических изменений в мозговой ткани. Однако в доступных литературных источниках данной информации недостаточно, некоторые аспекты противо-
речивы, что и определяет перспективность дальнейших исследований [8—11].
Цель настоящего исследования — изучение роли белков HSP-70 и HIF-16 в формировании ми-тохондриальной дисфункции, а также в реализации клеточного ответа на ишемию головного мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные исследования проводились в два этапа. Первый — исследования in vitro в суспензии нейронов с добавлением токсических доз глутамата, хлор-2,4-динитробензена (селективный ингибитор глутатион^-трансферазы), DNIC (динитрозольный комплекс железа с ци-стеином — донатор оксида азота), вещества которые в условиях in vitro в некоторой степени могут воспроизвести основные патобиохимические изменения в мозговой ткани, а именно развитие глутаматной эксайтотоксичности и нитрозатив-ного стресса, смещение тиол-дисульфидного равновесия. На втором этапе исследование геномного ответа клетки проводили на модельной патологии путем моделирования церебральной ишемии.
Для исследований in vitro нейроны выделяли из коры головного мозга растущих 4-недельных крыс линии Вистар. Выделение обогащенных фракций нейронов и нейроглии проводилось в два этапа. На первом этапе мозговая ткань дезинтегрировалась с целью получения клеточной суспензии, на втором — осуществлялось дифференциальное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы и фиккола. Для получения нейронов и нейроглии крыс декапитировали, быстро извлекали мозг. Кору головного мозга отделяли от белого вещества, измельчали и переносили в раствор, содержащий 7.5% поливинилпир-ролидона (ПВП), 1% -ный бычий сывороточный альбумин (БСА) и 10 мМ СаС12. Полученную суспензию фильтровали через три сита под незначительным давлением для уменьшения потерь ней-рональных клеток. Последовательно пропускали через сита клеточную суспензию и наслаивали на градиент, состоящий из 1 М и 1.75 М сахарозы. Центрифугирование проводили при 60 000 g в рефрижераторной центрифуге VAC-25. В результате центрифугирования получали два слоя и плотный осадок. Верхний слой представлен остатками ми-елиновых оболочек, второй слой состоит из гли-альных и нейрональных клеток. Осадок представлен телами нейронов со степенью чистоты 90%. В дальнейшем проводят дополнительную очистку второго слоя путем второго фильтрования и ультрацентрифугирования. Выделенные нейрональ-ные клетки отмывали от сахарозы и альбумина охлажденным физиологическим раствором [12]. Полученную таким образом клеточную суспензию разделяли на серии: интактную, серию с до-
бавлением глутамата (100 мкМ); хлординитро-бензена (80 мкм) и DNIC (250 мкМ). Забор проб для исследования проводился на 15-, 30- и 60-й минутах, методом иммуноблотинга исследовали концентрацию белков HSP-70, НИ1б. Для приготовления белковых проб клетки собирали, отделяя их от субстрата смесью растворов трипсина и вер-сена (1 : 1), трижды промывали в 10 мл холодного PBS, центрифугируя при 200 g в течение 5 мин. К клеточному осадку добавляли 100 мкл лизирую-щего буфера, состоящего из 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.5 % тритона X-100, 2мМ EDTA и 1 мМ PMSF (производство Sigma, США). Экстракты центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин, отбирали супернатант и измеряли в нем концентрацию общего белка по методу Бред-форда (Bradford, 1976). Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли (Laemmli, 1970). После перенесения белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее инкубировали в течение 1 ч с моноклональными антителами к HSP-70, Hifl^, и с вторичными антителами против иммуноглобулина (IgG) мыши, меченными пероксидазой хрена (Sigma, США) [13, 14].
Концентрацию в гомогенате головного мозга HIF- и HSP-белков определяли методом Ве-стерн-блот анализа. Белки разделяли в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли электроэлюцией в течение 45 мин. Преинкубацию Вестерн-блотов проводили в растворе TBST с 5%-ным обезжиренным молоком в течение 1ч. Затем вестерн-блоты инкубировали в присутствии первичных моноклональных антител (Santa Cruz Biotechnology) против HIF и HSP в разведении 1 : 1000 в течение 1 ч. После отмывки блоты инкубировали в присутствии вторичных антител (Santa Cruz Biotechnology), конъюгиро-ванных с пероксидазой хрена (разведение 1 : 2000) в течение 1 ч. Детекцию HIF и HSP осуществляли при помощи денситометрии в программе Adobe Photoshop.
О выраженности нитрозативного стресса в суспензии судили по накоплению нитротирози-на. Количественное измерение протеинов, содержащих нитротирозин, проводилось с помощью ELISA-набор Nitrotyrisine — набор для твердофазного иммуноферментного анализа нитротирози-на, основанный по принципу "сэндвича" [15].
Образцы и стандарты инкубируются в микропланшете, покрытой антителами, которые связывают нитротирозин. Во время инкубации нитро-тирозин захватывается солидносвязанным антителом. Биотинилированное второе антитело (трейсер) добавляется в ячейки к нитротирозину. Если нитротирозин присутствует в образце, трей-сер-антитело связывается с захваченным нитро-тирозином. Насыщенность цвета развивается
пропорционально количеству нитротирозина в образце. Концентрация нитротирозина в образцах, измерение которой проводится параллельно со стандартами, может быть определена по стандартной кривой.
Моделирование церебральной ишемии было выполнено на монгольских песчанках (Meriones uniculatus), массой 70—90 г, которые по данным литературы последних лет наиболее часто используются для моделирования нарушения мозгового кровообращения, что обусловлено разъединением большого круга кровообращения, слабо развитой системой коллатерального кровообращения. Нарушение мозгового кровообращения вызывали необратимой односторонней перевязкой сонной артерии [16].
На 4- и 12-е сут эксперимента выделенное ишемизированное полушарие головного мозга тщательно промывали охлажденным 0.9%-ным раствором KCl (4°С), и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.