научная статья по теме НАРУШЕНИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ ПРИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА НА КОРТИКОСТРИАТНОЙ МОДЕЛИ КУЛЬТУРЫ НЕЙРОНОВ Биология

Текст научной статьи на тему «НАРУШЕНИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ ПРИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА НА КОРТИКОСТРИАТНОЙ МОДЕЛИ КУЛЬТУРЫ НЕЙРОНОВ»

УДК 577.29

НАРУШЕНИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ ПРИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА НА КОРТИКОСТРИАТНОЙ МОДЕЛИ

КУЛЬТУРЫ НЕЙРОНОВ

© 2013 г. Д. Н. Артамонов1*, В. В. Коржова1, Д. Ву2, П. Д. Рыбальченко1, К. Им2, В. А. Красноборова1, О. Л. Власова1, И. Б. Безпрозванный1,2

1Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, лаборатория молекулярной нейродегенерации, 195251, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 29, Россия; *электронная почта: artdmitrii@gmail.com 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 5323 Harry Hines Blvd., Dallas, Texas, 75390 USA Поступила в редакцию 20.03.2013 г.

Болезнь Хантингтона (БХ) — тяжелое наследственное нейродегенеративное заболевание, неизлечимое в настоящее время. Одной из основных причин развития этого заболевания считается нарушение кортикостриатных связей, приводящее к характерным моторным нарушениям. В данной работе синаптическая передача между нейронами коры и стриатума изучена на смешанной кортико-стриатной культуре нейронов, использованной в качестве модели БХ. Культура нейронов получена из головного мозга мышей линии YAC128 с генетической мутацией, вызывающей болезнь Хантингтона. Первые нарушения отмечены уже на 14 день культивирования: нейроны коры культуры YAC128 отличаются повышенной спонтанной активностью по сравнению с культурой нейронов дикого типа. В то же время на 14 день морфологическое состояние дендритного дерева стриатных нейронов в модели БХ было нормальным, однако применение оптогенетического подхода показало, что уже в это время нарушаются синаптические контакты. К 19 дню культивирования активность кортикальных нейронов YAC128 опускается ниже нормы, что приводит к нарушениям на постси-наптической стороне — элиминации и морфологическим изменениям дендритных шипиков, которые, вероятно, приводят к нейродегенеративным процессам в ходе развития БХ.

Ключевые слова: синаптическая передача, болезнь Хантингтона, оптогенетика, дендритные шипи-ки, культура нейронов.

Б01: 10.7868/80233475513040026

Болезнь Хантингтона (БХ) — аутосомно-доми-нантное наследственное заболевание, вызываемое мутацией в гене, кодирующем белок хантинг-тин (НИ). В первом экзоне мутантного гена увеличено число тринуклеотидных повторов СЛО, кодирующих глутамин [1]. Если длина полиглута-минового участка превышает 40 аминокислотных остатков, то болезнь проявляется со 100% пене-трантностью и приводит к летальному исходу. К симптомам заболевания относятся как моторные нарушения — неконтролируемые отрывистые движения (хорея), так и нарушение когнитивных функций и психического состояния (депрессия), часто проявляющиеся раньше моторных расстройств [2]. В настоящее время отсутствуют методы лечения больных БХ, применяется только симптоматическая терапия, в основном для подавления непроизвольных моторных актов.

БХ рассматривают как болезнь, поражающую главным образом стриатум, так как гибели наиболее подвержены нейроны именно этой области — ГАМКергические средние шипиковые нейроны (СШН) [3], которые составляют 95% нейронов стриатума. Позже в ходе развития заболевания наблюдается нейродегенерация коры (третий, пятый и шестой слои), бледного шара, таламуса, гипоталамуса, черной субстанции и мозжечка [4—8].

Стриатум является одним из основных элементов сложной системы контроля поведения, он обеспечивает взаимодействие и регуляцию сенсо-моторной и когнитивной информации и мотивации [9]. Стриатум получает афферентные входы со стороны коры, специфических ядер таламуса и компактной части черной субстанции [10] и имеет два эфферентых пути — прямой и непрямой, связывающих стриатум с нейронами бледного шара и черной субстанции [11]. Согласно совре-

менным представлением о работе стриопаллидар-ной системы прямой и непрямой пути противоположны по своему физиологическому эффекту: активация прямого пути вызывает растормаживание таламокортикальных связей и обеспечивает двигательную активность, а активация непрямого — торможение этих связей и подавление моторных сигналов [12]. Таким образом, нарушения в работе любого из этих путей могут приводить к патофизиологическим изменениям моторного поведения.

К настоящему времени большое количество экспериментальных данных свидетельствует в пользу гипотезы о ключевой роли изменений кортикостриатных связей в развитии БХ [13]. Потеря скоординированной активности нейронов коры и стриатума обнаружена во всех животных моделях БХ еще до проявления ярких симптомов болезни и гибели нейронов [14, 15]. При этом нарушения, вероятно, происходят главным образом на уровне синаптической передачи — ряд исследований показал, что нарушение работы синапсов является одним из первых эффектов присутствия в нейронах мутантного хантингтина. К этим эффектам относится увеличение сопротивления мембраны СШН [16] и изменение ряда других характеристик мембраны (в том числе, кинетических характеристик калиевых каналов и кальциевых токов) как у СШН, так и у пирамидных клеток коры [17]. Таким образом, считается, что один из основных патологических процессов при БХ — нарушение кортикостриатной системы [18].

Целью настоящей работы было изучение си-наптической передачи в разработанной модельной кортикостриатной in vitro системе БХ. Важно отметить, что в монокультуре, без воздействия нейронов коры, СШН стриатума характеризуются отсутствием как шипиков, так и спонтанной активности [19]. Модель БХ на кортикостриатной культуре позволяет изучать синаптическую передачу, так как нейроны коры и стриатума функционально связаны и проявляют спонтанную активность. Важную роль в нормальной синаптической передаче играют дендритные шипики. Поскольку считается, что они претерпевают изменения во время приобретения нового опыта, при формировании памяти и старении [20], подобные процессы могут происходить и при развитии различных нейродегенеративных заболеваний. Однако мало известно о роли морфологических изменений дендритного дерева СШН при БХ, поэтому большое внимание в работе уделено исследованию дендритных шипиков. Регистрация электрической активности на СШН стриатума с одновременной оптогенетической стимуляцией нейрона коры для возбуждения пресинаптического потенциала действия позволяет моделировать функциональные связи, формируемые in vivo, и дает воз-

можность непосредственно изучать нарушения синаптических контактов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Кортикостриатные первичные культуры нейронов. Для приготовления культур использовали головной мозг новорожденных трансгенных мышей линии YAC128 (Jackson Labs, 004938), несущих мутантный аллель HTT человека [21]. Гетерозиготные самцы YAC128 скрещивались с самками дикого типа, и их потомство, состоящее из мышат дикого типа и YAC128, использовали на 1—2 день после рождения. Мышат генотипировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя праймеры к экзонам 44 и 45 гена HTT человека, после чего извлекали мозг и изготавливали смешанные культуры коры и стриатума мышей YAC128 и дикого типа (WT). Первичные культуры нейронов готовили по методике, описанной ранее [22]. Клетки культивировали на покрытых поли-Х-лизином (Sigma) 12 мм стеклах (Assistent) в среде Neurobasal-A (Invitrogen) с добавлением 2% B-27 (Gibco), 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco) и 1 ммоль/л Х-глутамина (Invitrogen). Культуры инкубировали 14—20 дней при температуре 37°С и 5% CO2.

Трансфекция нейронов плазмидами для экспрессии каналородопсина. Для экспрессии опсинов в нейронах использовали плазмиды, кодирующие каналородопсин ChR2 и галородопсин NpHR, слитые с геном белка GFP, под контролем промотора CMV (Addgene plasmids 15814, 14750) [23]. Трансфекцию проводили по описанной ранее методике [24]: культуру нейронов инкубировали с Ca-содержащим раствором плазмиды (1 мкг) до появления четко различимого осадка, после чего осадок растворяли в закисленной среде Neuroba-sal-A (Invitrogen) в течение 30 мин, культуру промывали средой для инкубации без добавления FBS. Трансфицированную культуру нейронов инкубировали в течение 14—19 дней при температуре 37°С и 5% CO2 и использовали для электрофизиологических экспериментов через 2—7 дней.

Регистрация электрической активности нейронов. Спонтанную и индуцированную электрическую активность нейронов в смешанной корти-костриатной культуре регистрировали с помощью метода локальной фиксации потенциала (пэтч-кламп) в конфигурации "cell-attached". Пипетки приготовляли из 10 см боросиликатных стеклянных капилляров с филаментом (Sutter), сопротивление пипеток составляло 3—5 МОм. Для инкубации клеток в течение эксперимента и заполнения пипетки использовали раствор следующего состава: 140 ммоль NaCl, 2.4 ммоль KCl, 10 ммоль HEPES, 10 ммоль глюкозы, 4 ммоль

Рис. 1. Иммуноцитохимическое окрашивание смешанной культуры нейронов коры и стриатума мышей дикого типа (а) и УЛС128 (б). DARPP-32 (на рисунке светло-серый,) и МЛР2 (на рисунке темно-серый) на 14 день культивирования.

CaCl2, 4 ммоль MgCl2, pH 7.2—7.4. Регистрация токов проводилась при фиксированном напряжении — 70 мВ. Данные анализировали и обрабатывали в программном обеспечении pClamp 9.0 (Molecular devices).

Для регистрации индуцированной активности нейронов применяли онтогенетическую стимуляцию. С этой целью использовали трансфици-рованные культуры нейронов, в которых с помощью флуоресцентного сигнала GFP находили кортикальные нейроны, экспрессирующие плаз-миду с каналородопсином. После этого нейрон возбуждался с помощью оптогенетической стимуляции синим светом (фильтр 450—490 нм), быстрый затвор Sutter Instruments применяли для создания кратковременных импульсов света при различной длительности экспозиции. Индуцированную электрическую активность регистрировали на этом же кортикальном нейроне либо на находящемся рядом СШН.

Иммуноцитохимическое окрашивание. Для им-

муноцитохимического окрашивания применяли первичные антитела — кролика к нейрональному маркеру MAP2 (Cell Signalling Technology) и мыши к маркеру СШН DARPP32 (Cell Signalling Technology), вторичные антитела — к антителам кролика и мыши, слитые с флуорофорами (Alexa Fluor 488 и Cy5, Invitrogen). После окраски готов

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»