ОНТОГЕНЕЗ, 2008, том 39, № 6, с. 420-429
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 577.17:591.82:57.053
НЕАДГЕЗИВНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ В КУЛЬТУРАХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ КРОВЕТВОРНЫХ ОРГАНОВ КРЫСЫ И МЫШИ1
© 2008 г. Э. И. Буеверова, Е. В. Брагина, Е. А. Молчанова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: bueverova_e@mail.ru Поступила в редакцию 11.02.08 г.
Окончательный вариант получен 05.05.08 г.
Проведенное изучение адгезивных свойств полипотентных мезенхимных стромальных клеток, определяемых по содержанию колониеобразующих единиц фибробластов костного мозга половозрелых крыс и мышей в популяциях клеток прикрепившихся и не прикрепившихся к культураль-ному пластику от 2 ч до 7 сут in vitro, выявило и сходство, и различие между ними. В обоих случаях происходит максимальное увеличение числа колониеобразующих единиц фибробластов в составе адгезивной популяции на 7-е сут культивирования in vitro, но колониеобразующие единицы фибробластов костного мозга мыши из неадгезивной популяции этого срока практически отсутствовали. Число колоний из неадгезивной популяции костного мозга крысы на 7-е сут культивирования, напротив, значительно возросло, и эта неадгезивная популяция при более длительном времени культивирования стала источником последующих неадгезивных субпопуляций, содержащих колониеобразующие единицы фибробластов. Показано, что в суспензии клеток, выделенных из печени 17-су-точных плодов крысы, спустя 7 сут культивирования in vitro также остается фракция не прикрепившихся к пластику колониеобразующих единиц фибробластов. В неадгезивных субпопуляциях колониеобразующие единицы фибробластов костного мозга сохранялись до 42 сут, а эмбриональной печени - до 30 сут. Обнаружено, что особенностью стромальных клеток-предшественников неадгезивных субпопуляций костного мозга крысы является сокращение времени формирования колоний до 7 сут (т.е. они формируются в 1.5-2 раза быстрее, чем в первичной культуре). Показано, что суммарное число колониеобразующих единиц фибробластов костного мозга из всех неадгезивных клеточных субпопуляций примерно в 6 раз превосходило таковое адгезивной популяции первичной культуры, а эмбриональной печени - в 7.4 раза. В связи с тем, что костный мозг млекопитающих остается предпочтительным источником мезенхимных стромальных клеток, использование неадгезивных субпопуляций в представленной культуральной системе позволит значительно повысить выход стромальных родоначальных клеток.
Ключевые слова: костный мозг, эмбриональная печень, мезенхимные стромальные клетки, неадгезивные клеточные субпопуляции.
Биологический и клинический интерес к ме-зенхимным стромальным клеткам (МСК) привел к интенсивным исследованиям их свойств, таких как пролиферативная способность, высокая степень гетерогенности, возможность самоподдержания, различные дифференцировочные потенции, а также адгезия к субстрату (Bianco et al., 2001; Baksh et al., 2004; Bobis et al., 2006; Kolf et al., 2007). Впервые эти клетки были выделены и описаны Фриденштейном с соавторами; они же более тридцати лет назад предложили метод выращивания in vitro колоний-клонов костномозговых фиб-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 06-04-48209) и Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
робластоподобных клеток, позволивший анализировать свойства и численность родоначальных клеток кроветворной стромы костного мозга и других кроветворных органов (Fridenstein et al., 1970, 1978; Fridenstein, 1976; Фриденштейн, Лурия, 1980). Этот метод и теперь широко используется в изучении МСК разного происхождения (Yamada et al., 2000; Smith et al., 2004; Peister et al., 2004; Ma-rom et al., 2005; Phinney, Prockop, 2007). МСК выявляют in vitro как клетки, образующие колонии фибробластов - КОКф, или колониеобразующие единицы фибробластов - КОЕ-Ф, что терминологически равноценно. Одним из основных критериев МСК является адгезия к пластику в стандартных культуральных условиях (Dominici et al., 2006). Это свойство используется для выделения
МСК из взвеси костномозговых клеток и дальнейшего роста в культуре. Данные многих авторов указывают на различное время, необходимое для прикрепления КОЕ-Ф к поверхности культу-рального флакона. По одним сведениям, практически все КОЕ-Ф прикрепляются в первые 90 мин культивирования, по другим - от 2 ч до 3-7 сут (Фриденштейн и др., 1973; Лациник, Епихина, 1973; Фриденштейн, Лурия, 1980; Castro-Malaspina et al., 1980; Vacek et al., 1990; Deryugina et al., 1995; Phinney et al., 1999; Yamada et al., 2000; Tanaka-Dou-zono et al., 2001; Hung et al., 2002; Peister et al., 2004).
В ряде ранних экспериментов мы наблюдали, что в начальные сроки культивирования костного мозга крысы, мыши и морской свинки к поверхности культуральных флаконов прикрепляется небольшая часть КОЕ-Ф, а оставшиеся в суспензии клетки не теряют клоногенной способности в последующих пересевах (неопубл. данные). Цель настоящей работы - определить численность КОЕ-Ф в популяции остающихся в суспензии клеток костного мозга половозрелых крыс и мышей в зависимости от продолжительности инкубации с 2 ч до 7 сут in vitro, а также содержание КОЕ-Ф в неадгезивных клеточных субпопуляциях костного мозга и эмбриональной печени крыс при более длительном культивировании.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследования выполнены на самках крыс Wistar неинбредного разведения весом 200-270 г, на 17-суточных зародышах крыс этой же породы, а также на самках мышей линии (CBA х C57BL/6) х F1 весом 22-24 г. Взвесь клеток, выделенную из костного мозга крыс, мышей и эмбриональной печени крыс, пропускали через капроновый фильтр, а клетки эмбриональной печени отмывали при трехкратном центрифугировании (1000 об/мин) в течение 5 мин. Число ядросодержащих клеток подчитывали в гемоцитометре. Суспензию костного мозга или эмбриональной печени (по 10 мл) в конечной концентрации 1 х 106 клеток в 1 мл питательной среды эксплантировали в пластиковые флаконы с площадью дна 25 см2 ("Corning", США) и культивировали в термостате при 37°С в атмосфере 5%-го СО2 в воздухе. Состав питательной среды: a-MEM ("Sigma", США) с добавлением 10% инакти-вированной эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", США), 1% раствора L-глютамина в концентрации 20 мM ("Sigma", США), 100 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
В одной группе экспериментов подсчитывали число колоний фибробластов из костного мозга половозрелых крыс и мышей в зависимости от времени культивирования. Через 2, 4 ч и 1, 2, 3, 4, 7 сут после эксплантации суспензии костномозговых клеток среду с неприкрепившимися клетками переносили в новые пластиковые флаконы, а
во флаконы с прикрепившимися клетками заливали свежеприготовленную полную ростовую среду. Каждые 7 сут культивирования адгезивных и неадгезивных клеточных популяций на всех сроках наблюдения проводили смену ростовой среды, после чего прикрепившиеся за это время клетки культивировали до образования дискретных колоний на 11-14-е сут роста и фиксировали. В другой группе опытов клеточные суспензии костного мозга половозрелых крыс и печени 17-суточных плодов крысы в первичной культуре инкубировали 7 сут, после чего не прикрепившиеся за это время к пластику клетки переносили в новые флаконы, а прикрепившиеся после смены ростовой среды культивировали до образования колоний. В дальнейшем по аналогии с предыдущей схемой неадгезивные клетки костного мозга и клетки эмбриональной печени каждые 7 и 5-6 сут роста соответственно переносили в новые флаконы и продолжали культивировать до истощения популяции КОЕ-Ф. Выросшие колонии фиксировали метанолом или 96%-ным этанолом и окрашивали по Гимза. Число колоний на флакон подсчитывали с помощью бинокулярной лупы. Опыты проводили в 2-3-кратной повторности, на каждую точку наблюдений подсчитывали колонии в 10-12 культуральных флаконах. Результаты обрабатывали статистически, для оценки достоверности различий использовали ¿-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оценка адгезивных свойств МСК из костного мозга половозрелых крыс и мышей в зависимости от продолжительности инкубации в первичной культуре. Как следует из рис. 1, при культивировании взвеси костного мозга крысы в течение 2, 4 ч, а также 1, 2, 3, 4 и 7 сут после эксплантации в культуру число КОЕ-Ф в составе адгезивных популяций (АП) возросло с 48.25 ± 9.06 до 151.5 ± 11.11 колоний на флакон. В неадгезивных популяциях (НП) колонии, образованные КОЕ-Ф после переноса суспензии не прикрепившихся к пластику клеток в новые флаконы, присутствовали в значительном числе на всех сроках наблюдения, достигая максимального на 7-е сут (103.8 ± 8.19 колоний на флакон).
При сравнении числа КОЕ-Ф в АП и НП костномозговых клеток крысы при продолжительности времени адгезии к пластику с 2 ч до 4 сут in vitro следует, что неадгезивная популяция на каждую точку наблюдения превышала адгезивную на 6.48-27.04 % и только на 7-е сут АП по числу колоний превысила НП (на 18.7%). Таким образом, существенная часть популяции МСК костного мозга крысы в продолжение 7 сут in vitro остается в суспензии, что характеризует ее пониженную адгезию к пластику.
2 4 1 2 3 4 7
ч сут
Рис. 1. Колониеобразование в адгезивных Я ,—♦—) и неадгезивных ( 0, - - о - -) популяциях костного мозга половозрелых крыс Wistar в зависимости от времени адгезии КОЕ-Ф к поверхности пластика в первичной культуре (а) и то же, представленное графически (•).
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - время культивирования; по оси ординат - число КОЕ-Ф на флакон.
При культивировании МСК костномозговых клеток мышей в течение 2 ч - 7 сут выявлены единичные КОЕ-Ф в АП, культивируемой 4 ч и 1 сут in vitro, но начиная со 2-х и по 7-е сут число КОЕ-Ф возрастало с 30.6 ± 5.86 до 81.7 ± 5.57 колоний на флакон (рис. 2). Наибольшее число КОЕ-Ф в НП наблюдали через 2 ч инкубации (33.2 ± 5.16 колоний на флакон) с постепенным снижением их до единичных колоний к 7-м сут культивирования in vitro. Сопоставление адгезивных свойств КОЕ-Ф из костного мозга крысы и мыши выявило и сходство, и различи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.