научная статья по теме НЕГИДРОЛИЗУЕМЫЙ АНАЛОГ АТР - 5'-АДЕНИЛИЛ-ИМИДОДИФОСФАТ (AMP-PNP) - НЕ ИНГИБИРУЕТ ATP-ЗАВИСИМОЕ СКАНИРОВАНИЕ ЛИДЕРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МРНК Химия

Текст научной статьи на тему «НЕГИДРОЛИЗУЕМЫЙ АНАЛОГ АТР - 5'-АДЕНИЛИЛ-ИМИДОДИФОСФАТ (AMP-PNP) - НЕ ИНГИБИРУЕТ ATP-ЗАВИСИМОЕ СКАНИРОВАНИЕ ЛИДЕРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МРНК»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 59 - 64

УДК 577.213

НЕГИДРОЛИЗУЕМЫЙ АНАЛОГ ATP -5-АДЕНИЛИЛ-ИМИДОДИФОСФАТ (AMP-PNP) -НЕ ИНГИБИРУЕТ ATP-ЗАВИСИМОЕ СКАНИРОВАНИЕ ЛИДЕРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ мРНК*

© 2015 П.А. Сахаров, А.С. Соколов, С.Ч. Агаларов**

Институт белка РАН, 142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 4; факс: +7(499)514-0218, электронная почта: sultan@vega.protres.ru

Поступила в редакцию 14.06.14 После доработки 22.07.14

Задача настоящей работы состояла в том, чтобы ответить на вопрос: возможно ли использование негидро-лизуемого аналога ATP — AMP-PNP — в качестве ингибитора ATP-зависимого сканирования лидерной последовательности эукариотической мРНК в исследованиях инициации трансляции. Проведено исследование образования рибосомных 48S инициаторных комплексов на стартовом кодоне кэпированной мРНК с лидерной последовательностью Р-глобиновой мРНК кролика. Исследование проводилось в системе, состоящей из индивидуальных компонентов инициации трансляции. Получены зависимости эффективности образования 48S инициаторных комплексов от концентрации ATP и времени инкубации в отсутствие и в присутствии AMP-PNP. Показано, что во всех исследованных случаях AMP-PNP никак не влияет на эффективность образования 48S инициаторных комплексов. Сделан вывод, что нерасщепляемый аналог ATP — AMP-PNP — не является ингибитором инициации трансляции у эукариот.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: инициация трансляции, рибосомный 48S инициаторный комплекс, AMP-PNP, туп-ринтинг.

Инициация трансляции является важнейшим этапом биосинтеза белка у эукариот: именно на этой стадии трансляции действуют основные механизмы регуляции белкового синтеза в клетке. Согласно классическому механизму инициации (сканирующая модель Козак [1]) рибосомная 40S субъединица в комплексе с белковыми факторами инициации связывается с кэп-структурой на 5'-конце лидерной последовательности мРНК и начинает ATP-зависимое движение (сканирование) в направлении от 5'-кон-ца к З'-концу вдоль цепи мРНК до достижения инициаторного кодона. Однонаправленность этого движения недавно была доказана экспериментально [2]. Несколько ранее была предложена диффузионно-храповиковая модель, согласно которой энергия гидролиза ATP обеспечивает однонаправленное движение путем пе-

Принятые сокращения: AMP-PNP — 5'-аденилил-имидодифосфат, негидролизуемый аналог АТР; CXR — карбокси-Х-родамин; н. — нуклеотид.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-167, 28.12.2014.

** Адресат для корреспонденции.

риодических изменений аффинности фактора инициации трансляции eIF4A, связанного с ри-босомной 40S частицей, к РНК-связывающему белку eIF4B и к мРНК, в результате чего ограничивается движение 43 S инициаторного комплекса назад и разрешается стохастическое (диффузионное) движение вперед вдоль цепи мРНК [3]. Фактор инициации eIF4A представляет собой РНК-зависимую ATPазу, катализирующую гидролиз ATP с образованием ADP и ортофос-фата [4]. Следовательно, если модель верна, то такой аналог ATP, как 5'-аденилил-имидоди-фосфат (AMP-PNP), у которого гидролизуемая ATPазой пирофосфатная связь между р- и у-фос-фатами заменена на негидролизуемую, казалось бы, должен ингибировать энергозависимое однонаправленное движение инициаторного 43S комплекса вдоль цепи мРНК и, соответственно, формирование 48S инициаторного комплекса на стартовом кодоне. В литературе, однако, имеются данные, согласно которым катализируемый фактором eIF4A гидролиз ATP не инги-бируется в присутствии AMP-PNP [5].

Для проверки возможности ингибирования однонаправленного сканирования лидерной последовательности эукариотической мРНК с

помощью нерасщепляемого аналога ATP (AMP-PNP) и дальнейшего использования этого реагента в исследованиях инициации трансляции мы использовали метод ингибирования удлинения праймера (так называемый «тупринтинг») [6] в модификации, разработанной в нашей лаборатории [7]. В качестве сканируемой лидер-ной последовательности мРНК была использована хорошо изученная лидерная последовательность глобиновой мРНК. Мы определили эффективность образования 48S инициаторно-го комплекса в зависимости от концентрации ATP и времени инкубации как в отсутствие, так и в присутствии AMP-PNP. Удивительно, но во всех случаях (в оптимальных и субоптимальных условиях) использование негидролизуемого аналога ATP — AMP-PNP — не приводило к ин-гибированию образования 48S инициаторного комплекса на стартовом кодоне.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Компоненты системы сборки инициаторных 48S комплексов. Природные и рекомбинантные факторы инициации трансляции, рибосомные субъединицы и природная мРНК ß-глобина кролика были получены, как описано ранее [7].

Проверка качества препарата AMP-PNP. В работе был использован препарат AMP-PNP компании «Sigma», США. Т.к. этот реагент являлся ключевым в данном исследовании, были проведены тесты на его качество. Получен масс-спектр AMP-PNP, который выявил полное соответствие измеренной молекулярной массы препарата его химическому составу. Кроме того, проведена реакция окисления люциферина лю-циферазой в присутствии AMP-PNP (эта реакция идет в присутствии АТР, причем гидролизу-ется его а—ß-связь). AMP-PNP оказался также реакционноспособен в этом тесте, поэтому был сделан вывод, что у данного препарата негидро-лизуемая связь находится в ß—у-положении, что соответствует химической формуле AMP-PNP.

Формирование рибосомных инициаторных комплексов. Сборку инициаторных 48S комплексов проводили следующим образом: 0,5 пмоль мРНК добавляли к охлажденной на льду смеси, состоявшей из 4 пмоль 40S рибосомных субъединиц, 5 пмоль eIF2, 3 пмоль eIF3, 3 пмоль eIF4F, 15 пмоль eIF1, 15 пмоль eIF1A, 3 пмоль eIF4A, 10 пмоль eIF4B и 1 пмоль Met-tRNAi в буфере, содержавшем 40 мМ Tris-OAc (pH 7,5), 3,7 мМ Mg(OAc)2, 2 мМ DTT, 0,25 мМ сперми-дин, 0,2 мМ GMP-PNP, 0,1 мМ ЭДТА, 120 мМ KCl, 0,3 ед/мкл ингибитора рибонуклеаз RiboLock RNase Inhibitor («Fermentas», Литва).

Смесь также содержала ATP и, где это необходимо, AMP-PNP (концентрации указаны в тексте и подписях к рисункам). Реакционную смесь объемом 20 мкл инкубировали при 37° в течение 1, 2, 5 или 15 мин.

Ингибирование удлинения праймера (тупринтинг). Концентрацию Mg2+ в смеси с преформи-рованными инициаторными комплексами доводили до 7 мМ. Это вызывало остановку реакции, т.к. при такой концентрации ионов магния формирование комплексов не происходит. Для проведения реакции удлинения праймера к смеси добавляли по 0,5 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 пмоль/мкл ДНК-праймера с флуоресцентной меткой и 0,3 ед/мкл обратной транскрипта-зы AMV RT («Promega», США). Реакционную смесь инкубировали при 37° в течение 30 мин. Продукты обратной транскрипции очищали экстракцией фенолом, осаждали 70%-ным этанолом и 0,7 М NH4OAc и растворяли в 20 мкл 90%-ного формамида на TBE-буфере. В каждый образец для капиллярного электрофореза добавляли аликвоты (0,5 мкл) флуоресцентно-меченных стандартов длин ДНК (карбокси-Х-ро-дамин - CXR, 60-400 н.; «Promega», США). Нуклеотидная последовательность ДНК-прай-мера для отжига на мРНК: 5'-[6-карбоксифлуо-ресцеин]-GGACTCGAAGAACCTCTG-3'.

Капиллярный электрофорез продуктов реакции удлинения праймера. Фрагменты кДНК, образовавшиеся в результате реакции удлинения праймера, анализировали с помощью капиллярного гель-электрофореза на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя. Собранные данные обрабатывали, используя программное обеспечение GeneMarker 1.5 (Soft-Genetics). Профили распределения флуоресценции кДНК были соотнесены с последовательностью мРНК с использованием флуоресцентно-меченных стандартов длин ДНК (CXR, 60-400 н.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как уже упоминалось выше, согласно классической модели рибосомная 40S субъединица в комплексе с белковыми факторами инициации (43 S инициаторный комплекс) сканирует цепь мРНК в направлении 5'—3' до достижения ини-циаторного кодона. На инициаторном кодоне AUG рибосомный комплекс фиксируется, формируя так называемый 48S инициаторный комплекс. Таким образом, по эффективности формирования этого 48S комплекса на инициа-

торном кодоне можно судить об эффективности процесса сканирования. Для определения эффективности образования рибосомного 48S инициаторного комплекса обычно используют метод ингибирования удлинения праймера, или тупринтинг [6]. В настоящей работе мы использовали модификацию этого метода, в которой 5'-конец праймера был помечен флуоресцентной меткой; анализ флуоресцентных продуктов проводили с помощью капиллярного электрофореза c оптической регистрацией образцов [7].

Поскольку ранее зависимость выхода 48 S инициаторных комплексов от концентрации ATP не оценивалась, мы сначала провели соответствующие эксперименты, результаты которых показаны на рис. 1. На рис. 1, а представлены электрофореграммы, демонстрирующие формирование 48S инициаторных комплексов на мРНК в широком диапазоне концентраций ATP. Характерный «трезубец» на правой стороне электрофореграмм указывает на позицию 48S рибосомного комплекса на инициаторном кодоне AUG, а интенсивность пиков трезубца отражает количество инициаторных рибосомных комплексов, достигших инициаторного кодона в результате сканирования. Рис. 1, б демонстри-

рует зависимость выхода 48S инициаторных комплексов от концентрации ATP, из которой видно, что полунасыщение субстратом наступает при концентрации ~0,01 мМ и достигает максимума при концентрации ATP 0,05 мМ. Мы решили проверить влияние AMP-PNP на формирование 48 S инициаторных комплексов в диапазоне концентраций ATP 0—0,05 мМ, т.е. в наиболее чувствительных точках, исходя из зависимости на рис. 1, б. На рис. 2 изображены электрофореграммы, показывающие выход 48S инициаторных комплексов в присутствии 2 мМ AMP-PNP и разных концентрациях ATP. Видно, что, несмотря на столь преобладающий избыток AMP-PNP по сравнению с ATP, эффективность образования 48S инициаторных комплексов не меняется и остается на том же уровне, что и в отсутствие AMP-PNP (ср. рис. 1, а и рис. 2). Следовательно, в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком