ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 2, с. 102-111
= ГАМЕТОГЕНЕЗ
УДК 591
НЕГОРМОНАЛЬНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ IN VITRO СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ ОСЕТРОВЫХ РЫБ
© 2014 г. Б. Ф. Гончаров, М. Н. Скоблина
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: skoblina38@mail.ru Поступила в редакцию 25.09.13 г.
Окончательный вариант получен 05.11.13 г.
Увеличение концентрации бикарбоната натрия в растворе Рингера для холоднокровных приводит к тому, что при инкубации овариальных фолликулов осетровых рыб происходит "спонтанное" созревание ооцитов. Созревание ооцитов наблюдается также при добавлении бикарбоната натрия в определенной концентрации к разбавленной среде Лейбовитца. Эффективная пороговая концентрация бикарбоната натрия зависит как от состава среды культивирования, так и, главным образом, от физиологического состояния фолликулов. Как свидетельствуют опыты с актиномицином Д, вызванное ионами бикарбоната созревание ооцитов не зависит от синтеза РНК. При попытке выяснить участие стероидогенеза в запуске "спонтанного" созревания было обнаружено, что и амино-глютатимид, и дилтиозем, и эстрадиол-17р не только не подавляют, а и способствуют созреванию ооцитов, индуцируемому ионами бикарбоната. Механическое удаление оболочек фолликула показало, что "голые" ооциты сохраняют способность созревать в среде с повышенной концентрацией бикарбоната натрия, однако в более узком диапазоне концентраций, чем при сохранении оболочек фолликула. Для объяснения парадоксального эффекта веществ, влияющих на стероидогенез, предложена гипотеза конкуренции за энергетический ресурс различных процессов, происходящих в фолликуле.
Ключевые слова: осетровые рыбы, ооцит, созревание, in vitro, среда культивирования, бикарбонат натрия, стероидогенез.
DOI: 10.7868/S0475145014020050
ВВЕДЕНИЕ
Воспроизведение in vitro того или иного биологического процесса является широко используемым подходом при его изучении. Применять этот прием для исследования механизма гормональной регуляции созревания ооцитов осетровых рыб стало возможным после того, как была разработана среда культивирования, в которой удавалось стабильно индуцировать этот процесс гона-дотропными препаратами. Было выяснено, что для этого достаточно увеличить до определенного значения концентрацию бикарбоната натрия в классическом растворе Рингера для холоднокровных (Гончаров, 1978). При этом пороговое значение концентрации бикарбоната натрия, обеспечивающее реакцию, может отличаться при работе с овариальными фолликулами разных самок. Обычно оно находится в пределах от 1 до 2 г/л. Было также показано, что по мере увеличения
концентрации бикарбоната натрия растет чувствительность фолликулов к гонадотропным гормонам гипофиза, а, начиная с определенного значения, сама среда приобретает индукционные свойства, то есть, ооциты начинают созревать в ней и в отсутствии гормонов.
Созревание ооцитов при культивировании их в среде, не содержащей гормональные препараты, обычно в литературе называют "спонтанным" созреванием. Существуют три возможных объяснения этого явления: 1) процесс индукции созревания запущен гормонами in vivo, а при извлечении фолликулов и их культивировании, происходит лишь завершение этого процесса, не требующее присутствия гормонов, 2) при извлечении фолликулов из тела самки и/или культивировании их в определенной среде происходит высвобождение ооцитов из-под влияния факторов, сдерживающих созревание и 3) какие-то элемен-
ты или свойства культуральной среды способны имитировать действие гормонов, то есть запускать процесс созревания ооцитов.
Хорошо известно, что созревание ооцитов рыб в норме индуцируется гонадотропными гормонами гипофиза, которые действуют на клетки стенки овариального фолликула. В результате этого воздействия вырабатывается стероид, действующий непосредственно на ооцит (см. Masui, Clark, 1979).
Были определенные основания полагать, что наблюдаемое при работе с фолликулами осетровых рыб спонтанное созревание является результатом индукционного воздействия среды, и, в частности, ионов бикарбоната.
Задачей нашего исследования было получить дополнительные данные о природе фактора спонтанного созревания ооцитов осетровых рыб, а также выяснить, что является точкой приложения его действия, и каков его возможный механизм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работы проводились на Краснодарском (Адыгейском) осетровом рыбоводном заводе на фолликулах стерляди (Acipenser ruthenus) и севрюги (Acipenser stellatus) в течение ряда лет. Овариаль-ные фолликулы извлекали из полости тела самки при помощи металлического щупа и помещали либо в раствор Рингера, модифицированный для осетровых рыб (РМО), содержащий выбранную в зависимости от задачи опыта концентрацию бикарбоната натрия (указана при описании результатов опыта), либо в 75% среду Лейбовитца (75% L-15). После этого их многократно промывали той же средой и раскладывали для инкубации в чашки Петри (диаметром 60 мм) обычно по 30—35 фолликулов на 7.5 мл среды. В тех случаях, когда условия инкубации фолликулов отличались, они приведены в разделе "Результаты". Инкубацию проводили либо в термостате при температуре 16 ± 0.5°C, либо при комнатной температуре 20 ± 2°C.
В опытах по изучению механизма спонтанного созревания использовали следующие вещества: аминоглютатемид (АМГ) — ингибитор превращения холестерина в прегненолон, актиномицин Д (АД) — ингибитор синтеза РНК, а также дилтио-зем — ингибитор кальциевых каналов. Эстра-диол-^ß был использован в качестве естественного ингибитора образования прогестерона (Spiegel et al., 1978). Все указанные вещества и L-15 получены из Сигмы. Фолликулы обрабатывали АД (5 мкг/мл), приготовленном на РМО с 0.5 г/л бикарбоната натрия (в этом РМО ооциты не созревают спонтанно), в темноте в течение 2 ч,
затем отмывали в трех сменах по 25 мл того же РМО. В контроле фолликулы выдерживали 2 ч в РМО с той же концентрацией бикарбоната натрия. По окончании инкубации (обычно через 36—48 часов) фолликулы фиксировали кипячением, а после разрезания ооцитов под бинокуляром лезвием безопасной бритвы регистрировали присутствие или отсутствие ядра ооцита — зародышевого пузырька (ЗП).
Оболочки фолликула удаляли остро заточенными пинцетами без специальной предварительной обработки, или после предобработки фолликулов бескальциевой средой. В ряде опытов полноту удаления оболочек контролировали под микроскопом после обработки "голых" ооцитов витальными красителями. В одном опыте для гарантированного удаления всех фолликулярных клеток удаляли наружный слой zona radiata.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние разных концентраций бикарбоната натрия на созревание in vitro ооцитов осетровых рыб
Опыты по изучению влияния разных концентраций бикарбоната натрия на созревание in vitro ооцитов были поставлены на фолликулах двух видов осетровых рыб — стерляди и севрюги. В опыте использовали две среды — РМО и среду 75% L-15, в которые были добавлены разные концентрации бикарбоната натрия. Извлеченные из самки фолликулы отмывали, соответственно, РМО, содержащим 0.25 г/л бикарбоната натрия, или 75% L-15, а затем инкубировали в этих средах с разными концентрациями бикарбоната натрия. Результаты опытов, поставленных на трех самках стерляди и трех самках севрюги, представлены на рис. 1 и 2.
Из представленных результатов видно, что процент созревших ооцитов увеличивается с ростом концентрации бикарбоната натрия как в РМО, так и в L-15. У большинства самок не обнаруживается существенных различий в чувствительности фолликулов к бикарбонату натрия в сравниваемых средах. Тем не менее, у двух самок (рис. 1, самка 1 и рис. 2, самка 1) процент ооци-тов, созревших при одинаковых концентрациях бикарбоната натрия, был явно выше в 75% L-15.
Влияние различных ингибиторов стероидогенеза на индуцированное бикарбонатом натрия созревание in vitro ооцитов севрюги
Актиномицин Д. Результаты опытов по влиянию АД на созревание ооцитов севрюги в РМО, содержащем увеличенную концентрацию бикарбоната натрия, представлены в табл. 1. У четырех
Рис. 1. Влияние разных концентраций бикарбоната натрия на созревание in vitro ооцитов стерляди. По оси абсцисс — концентрация бикарбоната натрия (г/л) в модифицированном растворе Рингера (сплошная линия) и в среде Лейбовича (пунктирная линия); по оси ординат — процент созревших ооцитов. Представлены результаты, полученные при культивировании овариальных фолликулов трех самок.
самок (2—5),ооциты которых созревали в разном проценте случаев в растворе Рингера, содержащем 3 г/л бикарбоната натрия, АД не оказывал
Таблица 1. Влияние актиномицина Д (АД) на созревание in vitro ооцитов севрюги
Среда культивирования
АД, 5 мкг/мл Самка 1 Самка 2 Самка 3 Самка 4 Самка 5
Процент созревших ооцитов
р-р Рингера, содержащий 3 г/л NaHCO3
+
0.00 3.33 60.00 46.67 63.33
Рис. 2. Влияние разных концентраций бикарбоната натрия на созревание in vitro ооцитов севрюги. Обозначения те же, что для рисунка 1.
статистически достоверного воздействия. В отсутствии "спонтанного" созревания действие АД также никак не проявлялось.
Аминоглютатемид. Результаты, приведенные в табл. 2, показывают, что независимо от того, при какой концентрации бикарбоната натрия происходило "спонтанное" созревание ооцитов, аминоглютатемид (АМГ) в концентрации 100 мкг/мл во всех случаях увеличивал процент созревших ооцитов. Более того, даже если созревания в среде инкубации не было вовсе (самки 3 и 6), обработка фолликулов АМГ приводила к созреванию практически всех ооцитов.
Дилтиозем. У всех исследованных самок при добавлении в среду культивирования ингибитора кальциевых каналов дилтиозема (100 мкМ) происходило увеличение процента созревших ооци-тов (табл. 3). Высокий процент созревания ооци-тов в присутствии дилтиозема наблюдался даже в тех случаях, когда сама среда не оказывала никакого индуцирующего действия (самки 3 и 4).
Таблица 2. Влияние аминоглютатемида (АМГ) на созревание in vitro ооцитов севрюги
Процент созревших ооцитов
Среда культивирования р-р Рингера, содержащий увеличенную концентрацию NaHCO3
3 г/л 2 г/л 1.5 г/л
АМГ, 100 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.