ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 456, № 5, с. 622-625
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 591.147:599.742.7
НЕИНВАЗИВНАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-НАДПОЧЕЧНИКОВОЙ СИСТЕМЫ У ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ЛЕОПАРДА © 2014 г. Е. А. Иванов, Н. В. Сидорчук, В. В. Рожнов, С. В. Найденко
Представлено академиком Д.С. Павловым 10.02.2014 г. Поступило 10.02.2014 г.
Б01: 10.7868/80869565214170307
Дальневосточный леопард (Рап&ега рагёш огь еп1а1*з) — самый редкий подвид кошачьих на Земле. Исторический ареал его охватывает северо-восток Китая, Корейский полуостров и южную часть Приморского края России [1]. В настоящее время сохранилась только небольшая популяция дальневосточного леопарда на юго-западе Приморья и в прилегающих районах Китая. Хотя популяция этого подвида остается относительно стабильной на протяжении нескольких десятилетий [2], очень малая численность (20—40 особей) и низкое генетическое разнообразие [3] делают подвид крайне уязвимым. Кроме того, дальневосточный леопард обитает в наиболее густонаселенных районах Приморья и испытывает сильное антропогенное воздействие, связанное не только с незаконным добыванием хищника и его жертв, но и с рекреационной нагрузкой и беспокойством из-за густой сети автодорог.
Для успешного сохранения дальневосточного леопарда необходимы детальные данные о состоянии его популяции и сведения о влиянии факторов внешней среды на физиологическое состояние животных в природных условиях.
Одним из подходов к характеристике физиологического состояния животных является оценка их гормонального статуса, в первую очередь уровня глюкокортикоидов. Глюкокортикоидные гормоны (кортизол и кортикостерон) играют важную роль в поддержании гомеостаза и энергетическом обмене млекопитающих. Повышение уровня глюкокортикоидов ведет к повышению концентрации глюкозы, запускает процессы глю-конеогенеза и катаболизма белков. Это дает животному возможность мобилизовать ресурсы организма в ситуациях, связанных как с сезонными
Институт проблем экологии и эволюции
им. А.Н. Северцова
Российской Академии наук, Москва
изменениями в поведении животных (например, с наступлением сезона размножения) и доступности пищи, так и с кратковременными стрессовыми воздействиями, требующими немедленной реакции (например, с агрессивным взаимодействием с конспецификом или нападением хищника) [4]. С другой стороны, повышенный уровень глюко-кортикоидных гормонов может свидетельствовать о том, что для поддержания гомеостаза в данных условиях животному требуются большие затраты энергии.
Таким образом, оценка уровня глюкокортико-идов позволяет оценить благополучие животного (в англоязычной литературе — animal welfare) и выявить конкретные факторы, оказывающие негативное влияние на организм.
Уровень глюкокортикоидов у диких животных обычно оценивают неинвазивно без непосредственного контакта с животным [5], так как отлов животного и забор крови, как правило, невозможно провести за короткий период времени, исключающий влияние самой процедуры на уровень глюкокортикоидов в крови. В последние годы не-инвазивные методы мониторинга гормонального статуса разрабатываются и активно используются для оценки благополучия животных в природных популяциях [6].
Видовые различия в метаболизме гормонов требуют валидации используемого подхода для неинвазивной оценки уровня глюкокортикоидов для каждого нового вида. Такие работы выполнены нами ранее с применением методики экстракции гормонов и их метаболитов из экскрементов с помощью 90% метанола и использованием коммерческих наборов реактивов компании "Имму-нотех" (Россия) для оценки кортизола в плазме крови. Для ряда видов нами была показана возможность оценки их стрессированности/благо-получия: для дальневосточного лесного кота [7], амурского тигра [8] и домашней кошки [9].
Целью работы была валидация (биологическая, физиологическая, аналитическая) данной методики для дальневосточного леопарда.
Для экспериментов использовали репродук-тивно активную самку дальневосточного леопарда в возрасте 13 лет из зоопарка г. Южно-Сахалинск. В качестве процедуры биологической ва-лидации была использована транспортировка животного. Для физиологической валидации использовали активацию коры надпочечников с помощью синтетического аналога АКТГ (АКТГ-тест). В качестве аналитической валидации использовали тест на параллелизм.
Транспортировку животного и АКТГ-тест проводили в августе—сентябре 2011 г. В зоопарке Южно-Сахалинска в течение 8 сут до транспортировки у самки дальневосточного леопарда ежедневно собирали экскременты. Затем животное обездвижили и авиатранспортом перевезли в транспортной клетке в Государственный природный заповедник "Уссурийский" ДВО РАН, где его содержали в клетке площадью 8 м2 и продолжали собирать экскременты. На 15-й день от начала эксперимента самке была сделана инъекция синтетического аналога адренокортикотропного гормона (Synacten, "Novartis Pharma GmbH", Германия) — 25 ME на 10 кг массы тела животного. Всего сбор образцов продолжали в течение 17 сут.
Аликвоты всех образцов экскрементов замораживали после сбора при —18°C, доставляли в замороженном виде на научно-экспериментальную базу "Черноголовка" ИПЭЭ РАН, где хранили при температуре — 18°C до проведения экстракции. Экстракцию образцов проводили по описанной ранее методике [7]. Полученный экстракт хранили при температуре —18°C до проведения анализа.
Концентрацию иммунореактивных веществ, связывающихся с антителами к кортизолу, определяли методом гетерогенного иммуноферментного анализа. Для этого были использованы наборы реагентов "Имуно-ФА Кортизол" компании "Имму-нотех" (Россия) и планшетный фотометр Multiscan EX ("ThermoScientific", Финляндия). Все процедуры проводили в соответствии с инструкцией к набору. Кросс-реактивность используемых антител к кортизолу составила: к преднизолону — 6%; к 11-дезоксикортизолу — 0.9%; к кортикостерону и дезоксикортикостерону — 0.6%; к тестостерону — 0.08%; к эстрадиолу, эстриолу и прогестерону — 0.07%. Каждое измерение проводили дважды для определения коэффициента вариации, а для дальнейшей обработки принимали среднее значение. При величине коэффициента вариации более 5% для данного образца проводили повторные измерения. Внутрипланшетный коэффициент вариации составил 2.43 ± 0.45.
Концентрацию кортизола в экскрементах животных, определяемую по связыванию с антите-
лами к кортизолу, пересчитывали на 1 г сухих экскрементов. Для этого аликвоты экскрементов массой 0.5—2 г взвешивали с точностью до 0.1 г на весах Ohaus ("Ohaus Corporation", США), а затем высушивали при температуре 80°C до достижения постоянной массы. Впоследствии рассчитывали влажность каждого образца и пересчитывали концентрацию кортизола на 1 г сухих экскрементов.
Для выявления пиковых значений и аутлайеров (значений, достоверно отличающихся от основной выборки) использовали метод, предложенный Гойманном с соавторами [10]. Средняя концентрация метаболитов кортизола в экскрементах составила 257 ± 63 (M± SD) нг/г. В качестве пиковых принимали те значения, которые превышали средний уровень на величину в 1.5 среднеквадратичных отклонения [10]. Такими точками были дни 12-й (первая проба после транспортировки животного) и 16-й (через сутки после введения АКТГ). Для выборки без пиковых значений рассчитывали среднее значение концентрации метаболитов кортизола — 237 ± 43 нг/г (M ± SD). Данное среднее значение ± 3 среднеквадратичных отклонения использовали для расчета достоверной границы базального уровня, выявляя аутлайеры [10]. Значения выше или ниже уровня, равного 367 нг/г (M ± 2SD), рассматривали как достоверно отличающиеся от базального уровня.
Первая дефекация животного после транспортировки была отмечена на четвертый день (12-й день эксперимента). Концентрация кортизола в экскрементах леопарда составила 377 нг/г (рис. 1), т.е. значительно превышала таковую в контрольный период. В дальнейшем она постепенно снижалась, достигнув 263 нг/г на 15-й день. Концентрация кортизола снова повысилась через сутки после инъекции АКТГ, достигнув 353 нг/г. На 17-й день концентрация метаболитов кортизола снизилась до базального уровня, составив 170 нг/г.
Таким образом, транспортировка самки дальневосточного леопарда вызывала достоверное повышение концентрации метаболитов кортизола в первых экскрементах после "стрессирующей процедуры". Это означает, что используемые антитела при измерении метаболитов кортизола в экскрементах улавливают изменения уровня нативного гормона в крови. Искусственная активация надпочечников с помощью синтетического аналога АКТГ также приводила к увеличению уровня метаболитов кортизола в экскрементах на следующий день после воздействия, которое, однако, не было столь значительным.
Анализ экстракта из пробы экскрементов леопарда при добавлении разных количеств натив-ного гормона показал, что построенная кривая не отличалась достоверно от таковой для кривой стандартов (рис. 2). Это позволяет использовать наборы для измерения кортизола для определе-
624
ИВАНОВ и др.
400
и 350
Д
ta 300 о
ид250 О
g I 200
cd О
л W t О
150
х о
2 100
50
Перевозка
АКТГ
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Сутки от начала эксперимента
Рис. 1. Изменение концентрации метаболитов кортизола в экскрементах самки дальневосточного леопарда (п = 1) после перевозки и инъекции АКТГ. Стрелками указаны день перевозки животного (8-й) и день инъекции АКТГ (15-й).
Logit(P/(1 - P)) 1.5 г
1.0 0.5 0
-0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5
" Стандарты
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
lg концентрации раствора, нг/г
Рис. 2. Кривые стандартов и пробы (экстракт из экскрементов леопарда) с добавлением различных количеств натив-ного кортизола, достоверно не различающиеся между собой. Р = В/В0 — отношение оптической плотности образца к оптической плотности нулевого стандарта (в отсутствие гормона).
ния метаболитов глюкокортикоидов в экскрементах дальневосточного леопарда.
Как было отмечено выше, используемые в работе коммерческие наборы для регистрации уровня кортизола в плазме крови были предварительно валидированы для измерения уровня метаболитов глюкокортикоидов в экскр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.