БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.3, c.424-433
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 576.341:591.391
НЕИНВАЗИВНЫЕ ОПТИКО-ЛАЗЕР НЫЕ П Р ИЕМЫ ПЕР ЕСАДКИ
ЯДЕР У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2010 г. Т.А. Свиридова-Чайлахян, Г.М. Кантор
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290ПущиноМосковской области
Поступила в р едакцию 24.12.09 г.
П р едставлены результаты исследований по разработке пр инципиально нового неинвазивного способа пер есадки ядер у млекопитающих, о снованного на оптико-лазерных манипуляциях, а также проведен их сравнительный анализ с общепринятыми приемами. Показано, что все ключевые этапы: энуклеацию ооцита, перенос соматической клетки (кариопласта) под зону пеллюцида ооцита, слияние энуклеированного ооцита и соматической клетки можно эффективно выполнять с помощью лазера, полностью заменив им механические микроманипуляторы и другие устр ойства, в том числе для электр о слияния. Результаты свидетельствуют о перспективности пр именения лазера в современной клеточной инженерии для работ с зародышевыми клетками млекопитающих, и особенно в технологиях терапевтического и репродуктивного клонирования.
Ключевые слова: клеточная инженерия, оптико-лазерные манипуляции, пересадка ядер, ооциты, соматическая клетка, энуклеация, слияние, реконструкция зародышей, клонирование.
Эксперименты по клонированию млекопитающих, предпр инятые в 70-х годах прошлого столетия, длительное время были неудачными из-за крайней чувствительности зародышевых клеток к микрохирургическим манипуляциям. П рогресс в исследованиях был достигнут с появлением комплексного метода пересадки ядер, сочетающего микрохирургию и электростимулируемое слияние клеток [1—14]. В нашей стране самые успешные опыты в этом направлении связаны с именем выдающегося ученого чл.-корр. РАН Левона Михайловича Чайлахяна. Под его руководством в 1985-86 гг. (независимо от зарубежны х исследователей) был разработан высокоэффективный метод локального направленного электростимулируемого слияния клеток и получены взрослые фертильные животные (мыши) из зародышей, реконструированных таким способом пересадки ядер [11-14].
Важнейшим достижением Л.М. Чайлахяна самых последних лет явилась разработка впервые в мире неинвазивных приемов реконстр ук-ции зародышей млекопитающих на основе оптико-лазерного микроманипулирования [1518]. Исследования были проведены в рамках Международного Ро ссийско-Тайваньского проекта РФФИ при совместном руководстве с пр оф. А.Е. Чои, Институт биофотоники Ян-Мин Университета, Тайпей (Dr. A.E. Chiou, Institute of ВюрИо^п^, National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan) и направлены на широкое внедрение в клеточную инженерию прин-
ципиально новой лазерной технологии, котор ая позволяет проводить уникальные микроманипуляции и точнейшие преобразования на уровне клетки и может заменить прежнюю методику пер есадки ядер, о снованную на применении механических микроманипулятор ов и стеклянных микроинструментов для энуклеации клеток в сочетании с последующим воздействием электрическими импульсами на энуклеированные клетки (цитопласты) и соматические клетки (ка-риопласты) для их слияния. К настоящему времени очевидно, что общепринятая методика (во всех своих модификациях, включая химическую энуклеацию, пьезоинъецирование и так далее) является весьма трудоемкой и связана с существенным повреждением ранних эмбрионов млекопитающих при их реконструкции [19-24]. Вероятно, именно эти обстоятельства сдерживают развитие данного направления исследований в фундаментальных и прикладных, в том числе и в биомедицинских целях.
В настоящем обзор е представлены работы, в которых показано, что с помощью лазерного луча можно успешно осуществлять весь комплекс манипуляций, лежащий в основе пересадки ядер у млекопитающих. Эти р езультаты позволяют надеяться, что дальнейший прогресс клеточной инженерии в области создания новых клеточных технологий клонирования может быть обусловлен использованием лазера.
Рис. 1. Лазерная энуклеация ооцитов; (а) - визуализация метафазной пластинки зрелых ооцитов на стадии метафазы II с помощью красителя Hoechst 33342 и ультрафиолетового облучения; (б) - облучение лазером области расположения метафазной пластинки в ооцитах; (в) - активированный ооцит на стадии пронуклеуса; (г) - облучение лазером проядрышка в пронуклеусе (показано стрелкой).
ВОЗМОЖНОСТЬ И СПОЛЬЗОВАНИЯ ЛАЗЕРА ДЛЯ ЭНУКЛЕАЦИИ КЛЕТОК
В первой сер ии исследований была показана возможность эффективной лазер ной энуклеации клеток для получения реципиентных цитопла-стов. Эксперименты были проведены с применением лазера Tsunami (Laser Physks, США), работающего в пикосекундном режиме с частотой повтор ения 80 M Гц, на длине волны 800 нм. Средняя мощность излучения варьировалась в пр еделах от 0,08 до 0,8 Вт. Цитопласты получали следующими способами: облучением области метафазной пластинки зрелых ооцитов на стадии метафазы II; облучением пронуклеуса в предва рительно активир ованных ооцитах; облучением мужского и женского пронуклеусов в зиготах; облучением ядер в бластомерах двухклеточных зародышей мышей. В результате исследований были определены необходимые параметры интенсивности, продолжительности воздействия и точки фокусировки лазерного импульса при энуклеации клеток. Для всех этих клеток параметры импульсов фактически были одинаковы.
П р и энуклеации зр елы х ооцитов на стадии метафазы II предварительно с помощью витального флуоресцентного ДНК-кр асителя Ho-eAst 33342 под ультрафиолетом (в течение 3-5 с) визуализировали метафазную пластинку (рис. 1а) и затем облучали область ее местоположе-
ния однократным лазерным импульсом мощностью 0,1-0,3 Вт и продолжительностью 0,3 с (рис. 1б). После облучения ооциты активировали стронцием [25], однако формирования пронуклеусов в них не наблюдали. Эффективность энуклеации ооцитов на стадии метафазы II, таким образом, со ставила 100%. Далее проводили лазерную энуклеацию активированных ооцитов на стадии образования пронуклеуса (рис. 1в), что позволяло избежать использования ультрафиолета и красителя HoeAst 33342. Облучали лазером ядрышко в пр онуклеусе активированного ооцита (рис. 1г) такими же параметрами лазерного импульса, что и при энуклеации зрелых ооцитов на стадии метафазы II. При культивировании in vitro 15% ооцитов проходили первое деление дробления (по типу партеногенеза), с последующей полной остановкой развития на двухклеточной стадии. Эффективность энуклеации в этом случае составила 85%.
При получении цитопластов с использованием зигот на стадии пр онуклеусов энуклеацию проводили посредством последовательного однократного облучения, локализованного на одно из ядрышек в женском пронуклеусе (рис. 2а,б) и затем в мужском пронуклеусе (рис. 2в,г), лазерными импульсами мощностью 0,1-0,3 Вт и продолжительностью от 0,02 с до 0,3 с. Эффективность энуклеации составила 94%. Лишь 6% зигот достигли двухклеточной стадии, но
Рис. 2. Лазерная энуклеация зигот на стадии пронуклеусов; (а) - женский пронуклеус зиготы (показано стрелкой), содержащий несколько проядрышек; (б) - облучение лазером одного проядрышка в женском пронуклеусе (показано стрелкой); (в) - мужской пронуклеус зиготы (показано стрелкой) с одним проядрышком; (г) - облучение лазером проядрышка в мужском пронуклеусе (показано стрелкой).
затем их развитие in vitro также останавливалось. При облучении проядрышка только в мужском или только в женском пронуклеусе зиготы были способны к делениям дробления в культуре in vitro, аналогично гино- и андро-генетическим эмбрионам, полученным с использованием приемов традиционной микрохирургии [26]. Лазерное облучение цитоплазмы вне зон нахождения пронуклеусов такими же импульсами не оказывало какого-либо негативного воздействия на зиготы, их доимплантаци-онное развитие в культуре in vitro было сопоставимо с развитием контрольных (необлучен-ных) зар одышей.
При энуклеации двухклеточных зародышей однократное прицельное облучение одного из ядрышек в ядре каждого бластомера лазерным импульсом продолжительностью 0,3 с полностью блокир овало их дальнейшее развитие. Эмбрионы сохраняли нормальную морфологию в течение последующих 24-48 часов культивирования in vitro. При энуклеации только одного бластомера двухклеточных зародышей (рис. 3а), второй, необлученный (интактный) бластомер был способен к делениям дробления, и, пр ак-
тически, все такие эмбрионы успешно развивались до стадии бластоцисты (рис. 3б-д).
П р едставленные результаты демонстрируют высокую точность действия лазера при энуклеации реципиентов. Вызывает особый интер ес тот факт, что лазерное облучение проядрышек полностью блокирует развитие активированных ооцитов и ранних зародышей. Механизмы остановки развития в результате такого воздействия лазером не ясны. Хотя функциональная роль и структура проядрышек в зародышевых клетках млекопитающих давно и интенсивно изучается [27-33], однако лазер с этой целью до сих пор не применяли. Многочисленные данные по лазерному и ультрафиолетовому облучению ядер соматических клеток млекопитающих свидетельствуют, что ядрышки являются наиболее чувствительным элементом к облучению [34-39]. Морфология и ультраструктура ядрышек может существенно изменяться после облучения [34,35,37]. Основной причиной этих изменений считают нарушение метаболизма рРНК, а также белковых компонентов, необходимых для поддержания нормальной структуры ядрышек [34,36,37]. Как известно, в начальный период раннего эмбриогенеза мле-
Рис. 3. Лазерная энуклеация бластомера в двухклеточных эмбрионах; (а) - облучение лазером ядрышка в ядре одного бластомера; (б) - спустя 30 часов после облучения в культуре in vitro деления дробления наблюдаются у необлученного бластомера, облученный бластомер сохраняет свою морфологию (показано стрелкой); (в) -спустя 48 часов культивирования in vitro эмбрион на стадии морулы с кавитацией; (г) - спустя 60 часов эмбрион на стадии бластоцисты; (д) - спустя 72 часов культивирования in vitro наблюдается выход бластоцист из оболочки, при этом первым из зоны пеллюцида вытесняется облученный (энуклеированный) бластомер (показано стрелками).
копитающ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.