научная статья по теме НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛА ПТЕНЦОВ ЖУРАВЛЕЙ ПО ДНК ИЗ КАПИЛЛЯРНЫХ СОСУДОВ АЛЛАНТОИСА Биология

Текст научной статьи на тему «НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛА ПТЕНЦОВ ЖУРАВЛЕЙ ПО ДНК ИЗ КАПИЛЛЯРНЫХ СОСУДОВ АЛЛАНТОИСА»

ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 5, с. 372-376

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 575.18:598.241.2

НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ

ПОЛА ПТЕНЦОВ ЖУРАВЛЕЙ ПО ДНК ИЗ КАПИЛЛЯРНЫХ СОСУДОВ АЛЛАНТОИСА

© 2013 г. Е. А. Мудрик, Т. А. Кашенцева*, Е. А. Гамбург, Е. Ю. Гаврикова**, Д. В. Политов

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Губкина, д.3 *Питомникредких видов журавлей, Окский государственный заповедник 391072 Рязанская обл., Спасскийр-он, п. Брыкин Бор **Станцияреинтродукцииредких видов птиц, Хинганский государственный природный заповедник

675740, Амурская обл., п. Архара

E-mail: mudrik@vigg.ru Поступила в редакцию 27.02.13 г. Окончательный вариант получен 11.04.13 г.

На четырех видах журавлей (подсем. Gruinae, Aves), размножавшихся в Питомнике редких видов журавлей Окского заповедника в течение 2009—2012 гг., продемонстрирован неинвазивный метод определения пола птенцов после их вылупления на основе ДНК, выделенной из капиллярных сосудов аллантоиса подскорлуповых оболочек яиц. Используя молекулярный маркер пола ЕЕ0.6, установлен пол 26 птенцов стерха Grus leucogeranus, 15 птенцов японского журавля G. japonensis, четырех птенцов серого журавля G. grus и одного птенца журавля-красавки Anthropoides virgo. Данный метод может быть рекомендован для определения пола птенцов и соотношения полов у журавлей, размножающихся как в искусственных условиях, так и в природных популяциях.

Ключевые слова: журавли, определение пола, аллантоис, подскорлуповая оболочка, ДНК, неинва-зивные молекулярные методы.

DOI: 10.7868/S0475145013050054

Птицы семейства Журавлиных (Gruidae) не обладают выраженным внешним половым диморфизмом. Как правило, самцы журавлей крупнее, чем самки (Флинт, 1987), однако использование лишь размерно-весовых критериев не гарантирует установление пола даже у взрослой птицы (Swengel, 1996). Акустический метод позволяет определять пол журавлей по особенностям вокализации не ранее, чем в возрасте 8—12 месяцев, когда происходит "голосовое созревание" птиц (Walkinshaw, 1973). Показано, что самцы издают более низкие звуки, чем самки (Carlson, Trost, 1992; Брагина, Бёме, 2007), но чаще всего это можно установить только при исполнении унисо-нальных криков в дуэте с брачным партнером (Archibald, 1976; Swengel, 1996). Определение пола у птенцов журавлей еще более затруднительно не только в связи с отсутствием морфометриче-ских различий, но и различий в свистовых звуках (Кленова и др., 2005; 2008). Вместе с тем, проблема половой дифференциации птенцов чрезвычайно актуальна при разведении журавлей в ис-

кусственных условиях и для ведения племенных книг, поскольку большинство видов этих птиц являются редкими и охраняемыми как в России, так и в мире (Meine, Archibald, 1996).

Наиболее точная половая идентификация птиц, в том числе на ранних этапах онтогенеза, достигается с помощью анализа изменчивости генов, локализованных в половых хромосомах у ге-терогаметных самок (кариотип WZ) и гомогамет-ных самцов (ZZ). Наиболее распространенными ДНК-маркерами пола у птиц являются ген хро-мохеликазы (Ellegren, 1996; Griffiths et al., 1996; 1998) и уникальная последовательность W-хро-мосомы EE0.6 (0.6 т.п.н. фрагмент &oRI) (Ogawa etal., 1997; Itoh et al., 2001). Механизм определения пола с помощью маркера EE0.6 заключается в выявлении специфической последовательности фиксированного размера на W-хромосоме самок. При этом данный маркер содержит общий для самцов и самок Z/W внутренний контроль, являющийся частью экзона — консервативной последовательности сцепленного с полом гена (Itoh

НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛА ПТЕНЦОВ

373

et al., 2001). Таким образом, в полимеразной цепной реакции (ПЦР) у самцов амплифицируется один фрагмент ДНК известной длины, дающий на электрофореграмме однополосный спектр, а у самок — два ПЦР-продукта, один из которых совпадает по размеру с "мужским" фрагментом, а другой специфичен только для самок (двухполосный спектр).

Для молекулярной диагностики пола птенцов первых месяцев жизни забор крови представляет очевидный риск, поэтому неинвазивные методы получения материала — источника ДНК особенно важны. Капиллярные сосуды в аллантоисе яйца являются частью кровеносной системы птенца — их сообщение с пупочными сосудами обеспечивает дыхательную и выделительную функции развивающегося эмбриона (Гилберт, 1993). После успешного вылупления птенца в подскорлуповой оболочке яйца остается редуцированный аллан-тоис, часто с сохранившими капиллярными сосудами, которые могут служить материалом для выделения ДНК (рис. 1). Об использовании сосудов аллантоиса как источника ДНК для определения пола у эмбрионов и "новорожденных" птенцов известно из работ по домашним птицам (Turkyil-maz et al., 2010; Bozkayaa et al., 2013). Сведения о применении этого метода у редких видов птиц, разводимых в искусственных условиях или размножающихся в природе, отсутствуют. Поскольку в центрах разведения журавлей существует практика сохранения и поддержания маркированных коллекций скорлупы яиц, мы обратили внимание на возможность использования таких коллекций для определения пола вылупившихся птенцов.

В течение четырех сезонов размножения (2009—2012 гг.) журавлей в Питомнике редких видов журавлей Окского государственного природного биосферного заповедника (далее — Питомник) мы тестировали методику молекулярного определения пола на 44 птенцах четырех видов журавлей с использованием капиллярных сосудов аллантоиса (таблица). Аллантоис яиц удалось взять для генетического анализа не от всех птенцов и не от всех содержащихся в Питомнике видов журавлей, поскольку во многих случаях родители съедали скорлупу сразу после вылупления птенцов. Всего доступными для работы оказались подскорлуповые оболочки 26 яиц стерха (Grus leucogeranus Pallas), четырех яиц серого журавля (G. grus L.,) и одного яйца журавля-красавки (Anthropoides virgo L.). Кроме того, подскорлуповые оболочки 15 яиц японского журавля (Grus japonen-sis Muller) были получены со Станции реинтродук-ции редких видов птиц Хинганского государственного природного заповедника. В 2009—2012 гг. на Станцию реинтродукции были переданы яйца от

аллантоис яйца

г- - i > V-:- -- .

Рис. 1. Фотография аллантоиса яйца японского журавля с капиллярными сосудами.

производителей японских журавлей Питомника для инкубации и выращивания птенцов с последующим их выпуском в природу на территории Амурской области — в пределах естественного гнездового ареала данного вида. Японский журавль и стерх — наиболее редкие в России виды журавлей, занесенные в Красную книгу Российской Федерации (I категория статуса) и Красный список Международного союза охраны птиц. Журавль-красавка и серый журавль — самые распространенные в России виды журавлей, однако охраняемые на региональном уровне в связи с угрозами местам их обитаний и, как следствие, сокращающейся численностью.

Выделение ДНК из препарированных капилляров аллантоиса проводили с помощью ионообменной смолы Chelex100 (Walsh et al., 1991). В качестве маркера пола использовали последовательность ЕЕ0.6, амплифицированную с помощью комбинации праймеров A (AWS05/NRD4: 5'-CACCCTG-GATTGGACAACCTATTTC- 3'; 5'-TCAGAG-CACTCTTTCCAGGAA-3') и B (SINT-F/SINT-R: 5'-TAGGCTGCAGAATACAGCAT-3'; 5'-TTGTG-CAGTTCTAGTCCATA-3'), адаптированную для журавлей (Bao et al., 2009a; 2009b) и протестированную нами ранее на разных видах журавлей с известным полом (Мудрик и др., 2011; Мудрик и др., 2013). Условия ПЦР были следующими: первичная денатурация при 94°С — 5 мин, далее 30 циклов, включающих денатурацию при 94°С — 50 с, отжиг праймеров при 57°С — 50 с, элонгацию при 72°С — 50 с, и завершающая элонгация при 72°С — 10 мин. Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1.5% агарозном геле (буферная система TAE) при напряжении 120 В с последующим окрашиванием геля бромистым этидием и визуализацией ампликонов в ультрафиолетовом

капиллярные сосуды

374

МУДРИК и др.

-300 -150

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера пола ЕЕ0.6 (АВ) у птенцов журавлей, родившихся в 2012 г. Порядок образцов: 1—3 — стерх; 4 — маркер длин фрагментов; 5, 6 — японский журавль, 7 — журавль-красавка; 8, 9 — серый журавль. Пол птенцов: 1, 3, 7, 8 — самцы, 2, 5, 6, 9 — самки. Числами обозначены размеры фрагментов в парах нуклеотидов.

свете с помощью системы гель-документации Kodak Edas 290.

Как и ожидалось, у птенцов всех четырех видов журавлей электрофоретический спектр EE0.6 самцов был представлен одним вариантом с молекулярным весом 150 пар нуклеотидов (п.н.), "женский" спектр — двумя полосами, 150 и 300 п.н. (рис. 2). В таблице приведены результаты

определения пола птенцов по годам. Так, за три года среди 26 стерхов идентифицировано поровну самок и самцов, среди 15 японских журавлей за четыре года — восемь самцов и семь самок, из четырех серых журавлей за три года — три самки и один самец, один птенец красавки, родившийся в 2012 г., оказался самцом. В целом за четыре года среди 44 птенцов четырех видов 23 были идентифицированы как самцы и 21 — как самки.

Таким образом, мы продемонстрировали, что неинвазивный метод идентификации пола птенцов по ДНК, выделенной из капиллярных сосудов аллантоиса, позволяет определять пол журавлят сразу после их вылупления. Кроме того, данный метод может использоваться при ретроспективном установлении пола птиц, реинтродуцирован-ных в природу, но после которых сохранилась скорлупа с подскорлуповыми оболочками.

Можно отметить также, что примененный нами ДНК-маркер пола ЕЕ0.6 эффективен не только в отношении видов журавлей, включенных в данную работу, но и для таких видов как черно-шейный (G. nigricollis Przewalski) (Bao et al., 2009b), даурский (Grus vipio Pallas) и черный (G. monacha

6

3

4

5

Результаты молекулярного определения пола у птенцов четырех видов журавлей в период 2009—2012 гг. с использованием ДНК, выделенной из капиллярных сосудов аллантоиса после вылупления птенцов

Вид журавлей Год рождения Количество птенцов Самцы Самки

2010 8 4 4

2011 6 4 2

Стерх 2012 12 5 7

26 13 13

2009-2010 9 5 4

2011 4 3 1

Японский журавль 2012 2

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»