ЭКОЛОГИЯ, 2011, № 6, с. 403-408
УДК 575.17
НЕИНВАЗИВНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В ИССЛЕДОВАНИЯХ ЭКОЛОГИИ ИРБИСА: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
© 2011 г. В. В. Рожнов*, Е. Ю. Звычайная*, А. Н. Куксин**, А. Д. Поярков*
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН 119071 Москва, Ленинский просп., 33 E-mail: rozhnov.v@mail.com; cernus@yandex.ru **Государственный природный биосферный заповедник "Убсунурская котловина" 667010 Республика Тыва, Кызыл, ул. Калинина, 144 А Поступила в редакцию 04.05.2011 г.
При помощи молекулярно-генетических методов проведена видовая и индивидуальная идентификация 117 образцов хищных животных, собранных в природе. Видовая принадлежность установлена для 85.5% проб. По результатам анализа нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b мтДНК определены образцы ирбиса (Uncia uncia) — 40%, лисицы обыкновенной (Vulpes vulpes) — 48%, волка (Canis lupus) — 6% и рыси (Lynx lynx) — 5%. Анализ 8 микросателлитных локусов позволил описать генотипы 13 особей ирбиса. Пол определен для 11 животных.
Ключевые слова: митохондриальная ДНК, микросателлитный анализ, идентификация, экскременты, ирбис.
При эколого-поведенческих исследованиях редких видов млекопитающих и разработке методов их сохранения необходимо привлечение новейших лабораторных методов, позволяющих проводить идентификацию особей по следам их жизнедеятельности. Подобный молекулярно-генетический метод уже используется нами для индивидуальной идентификации особей амурского тигра (Рожнов и др., 2009) и опробован для популяции ирбиса Северо-Западной Индии, Центрального Китая и Южной Монголии (1апе£ка й а1., 2008).
Ирбис, или снежный барс (Ьпс1а ыпаа 8скгеЪег, 1775) — единственный представитель рода, эндемик Центральной Азии и один из малоизученных видов млекопитающих России. Ареал ирбиса простирается от Гиндукуша в Афганистане до восточных частей Куньлуня в Китае, от гор южной Сибири до Гималаев в Индии, Непале и Бутане, включая все основные горные системы Средней и Центральной Азии. В России ареал вида охватывает горные хребты Алтая, Саян, горы Тувы, хребты, обрамляющие оз. Байкал. Ареал ирбиса в России представляет собой сильно фрагментированные островные участки потенциальных местообитаний, общая площадь которых около 58000 км2 (Лукаревский, Поярков, 2007).
Такие важные аспекты биологии ирбиса, как структура популяции, особенности расселения, численность, сезонные миграции, поведение и размеры участков обитания, до сих пор остаются слабо исследованными. Это связано в основном с биологическими особенностями и. ыпаа, труднодоступ-
ностью его мест обитания в природе, сезонными миграциями и низкой плотностью вида. Данные факторы определяют сложность ирбиса как объекта для проведения полевых исследований, что затрудняет разработку адекватных мер его охраны, в том числе и на территории России.
Цель данной работы — молекулярно-генетиче-ский анализ собранных в природе образцов для оценки уровня изменчивости выбранных маркеров и их пригодности для индивидуальной идентификации особей ирбиса из западной Тувы и соседней с ней монгольской популяции.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Молекулярно-генетическая идентификация состоит из двух этапов: первичное установление видовой принадлежности образца ткани животного или следов его жизнедеятельности и последующая индивидуализация. В работе использованы образцы, полученные неинвазивными методами, — шерсть и экскременты. Пробы были собраны А.Н. Куксиным.
Всего исследовано 117 образцов (10 — шерсти и 107 — экскрементов), собранных в природе (Тува, Северная Монголия, Северная Индия, Киргизия). Из горных районов Тувы поступило 67 образцов хищных животных: 46 (в том числе 3 образца шерсти) — из Монгун-Тайгинского района и 21 (2 образца шерсти) — из Эрзинского и Тере-Хольского районов. В Убсунурском аймаке Монголии собрано 44 образца. Кроме того, были получены 2 образца
Таблица 1. Праймеры, использованные для видовой и индивидуальной идентификации особей ирбиса (Ozawa ег а1., 1997; .Тапеека ег а1., 2008)
Локализация мтДНК/хромосома Название праймера Нуклеотидная последовательность праймера Размер фрагмента, н.п.
мтДНК GLU 5'-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTT G-3' 450
мтДНК CB2 (H15149) 5'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTC A-3'
мтДНК CYTB-SCT-F 5'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3' 148
мтДНК CYTB-SCT-R 5'-TATTCTTTATCTGCCTATACATRCACG-3'
A1 PUN229-F 5'-AGACAAACTGACAAGCTTAGAGG-3' 103-113
A1 PUN229-R 5'-TCATGTCTTTACATTCATTTCTTTTT-3'
A2 PUN124-F 5'-CCATTCCCTCCCTGTCTGTA-3' 90-100
A2 PUN124-R 5'-TGTCCTCAAACCATAGACAGTTTC-3'
D1 PUN935-F 5 '-GCTGCTGTGACCTTCTGTGA-3' 110-120
D1 PUN935-R 5 '-CAGTGTTCCTGGTTTGCTCA-3'
B3 PUN1157-F 5'-GAGAGTGCAGTCAGCCAGGT-3' 95-105
B3 PUN1157-R 5'-TGAAATTCAGCTGCTTCAACTC-3'
C2 PUN894-F 5'-CATGCCAGACTGCATTTGTT-3' 105-115
C2 PUN894-R 5'-CCCACACATGACAATCCTGTT-3'
D3 PUN132-F 5 '-CGAAATGCAGTAATGTTAGTTTTACA-3' 119-123
D3 PUN132-R 5'-CACGGGTTCGTCTCTTTTG-3'
A3 PUN272-F 5'-CACCTTTGCATCCAATAAATTC-3' 120-130
A3 PUN272-R 5'-AACTACCTTTACCTCCTTCCAAA-3'
B2 PUN834-F 5'-AAACACGTGCGCATGTAGAC-3' 105-115
B2 PUN834-R 5'-TGGAAGTGTGGTTTGACAGC-3'
шерсти из Северной Индии (долина Спашу) и 4 — из Киргизии.
В исследовании использовали образцы, фиксированные в силикогеле. Тотальную ДНК выделяли с помощью специального набора реактивов (QIAamp DNA Stool Mini Kit, QIAGEN), зарекомендовавшего себя в качестве лучшего метода для выделения ДНК из экскрементов кошачьих (Bhagavatula, Singh, 2006).
При определении видовой принадлежности образцов проводили амплификацию и последующее секвенирование фрагментов гена цитохрома b. Для анализа митохондриальной ДНК (мтДНК) использовали праймеры GLU и CB2 (H15149) (Ozawa et al., 1997), универсальные для всех млекопитающих, и праймеры, специфично связывающиеся с мтДНК хищных: CYTB-SCT-F, CYTB-SCT-R (JaneCka et al., 2008) (табл. 1). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием 2 мкл готовой пцр-смеси (Диалат, Москва), 1—2 мкл полученного раствора ДНК, 1 мкл прямого праймера (5 пмоль/мкл), 1 мкл обратного праймера (5 пмоль/мкл), с добавлением SmartTAQ полимера-зы (Диалат, Москва); общий объем смеси составлял 10 мкл. ПЦР с праймерами GLU и CB2 осуществляли при помощи амплификатора "Tetrad2"(BIO-RAD, США) при следующих условиях: 94°С — 3 мин (1 цикл); 94°С - 15 с, 56°С - 15 с, 72°С - 50 с (35 циклов); 72°С — 10 мин (1 цикл). Условия проведения ПЦР с праймерами CYTB-SCT-F, CYTB-
SCT-R: 95°С - 15 с, 55°С - 30 с, 72°С - 1 мин (40 циклов).
Очистку продукта амплификации проводили методом осаждения раствором этилового спирта с добавлением 5М ацетата натрия.
Для индивидуальной идентификации выбраны 8 микросателлитных локусов, используемых зарубежными авторами (1апе£ка ег а1., 2008) для геноти-пирования особей ирбиса. Данные микросателлит-ные локусы локализованы в разных хромосомах и содержат преимущественно динуклеотидные повторы (СА)„/^Т)п/(СТ)п/^А)п. Нуклеотидные последовательности праймеров и ожидаемый диапазон длин фрагментов приведены в табл. 1. Для каждой пары один олигонуклеотид (прямой) был модифицирован флуоресцентной меткой. ПЦР проводили в 10 мкл с использованием 1 мкл готовой пцр-смеси (Диалат, Москва), 1-2 мкл полученного раствора ДНК, 1 мкл прямого праймера, меченного флуоресцентной меткой (5 пмоль/мкл), 1 мкл обратного праймера (5 пмоль/мкл) с добавлением 8шагЯАр полимеразы (Диалат, Москва). Амплификацию осуществляли при следующих условиях: 95°С - 15 с, 55°С-15 с, 72°С - 30 с (40 циклов); 72°С - 30 мин (1 цикл). Для каждого микросател-литного локуса определяли необходимую степень разведения ПЦР-продукта для получения оптимального сигнала при фрагментном анализе, для некоторых локусов проводили оптимизацию условий ПЦР Для каждого образца с каждой парой праймеров проведено минимум 3 ПЦР.
НЕИНВАЗИВНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
405
Таблица 2. Количество идентифицированных образцов
Происхождение образцов Всего образцов (из них шерсть), шт. Прошли видовую идентификацию (из них шерсть), шт. Число проб ирбиса, шт. Индивидуально идентифицировано, шт. Число описанных генотипов (животных)
Цаган-Шибету, Монгун-Тайгин- 46 (3) 41 (3) 12 (3) б 4
ский район, Тува
Цаган-Шиву, Эрзинский и Тере- 21 (2) 13 2 - -
Хольский районы, Тува
Убсунурский аймак, Монголия 44 41 24 17 7
Киргизия 4 (2) 2 (1) - - -
Долина Спангу, Северная Индия 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 2
Пол животных определяли с использованием двух локусов (Amely, ZFY/X), находящихся в половых хромосомах (Pilgrim et al., 2005; JaneCka et al., 2008). Ген амелогенин Y (Amely) находится в Y-хро-мосоме и амплифицируется только у самцов. У гена белка цинковых пальцев ZFY, расположенного в Y-хромосоме, имеется гомолог в X-хромосоме, отличающийся по размеру. Таким образом, амплификация двух аллелей данного гена свидетельствует о принадлежности образца самцу, одного — самке. "Прямые" праймеры в обоих случаях были модифицированы флуоресцентной меткой.
Электрофорез, чтение нуклеотидных последовательностей мтДНК и определение длин продуктов амплификации микросателлитных локусов, а также фрагментов половых хромосом выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили с использованием набора реактивов BigDye Terminator kit 3.1 (Applied Biosystems). При фрагментном анализе в качестве размерного стандарта использовали LIZ500. Для визуализации сигнала применяли четыре флоуресцентные метки разного спектра светимости: TAMRA, R6G, ROX, FAM (Sintol, Москва). Видовую принадлежность ДНК определяли по наибольшей гомологии полученных нуклео-тидных последовательностей с последовательностями международной генетической базы данных "GenBank" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) при помощи опции BLAST Данные обрабатывали с помощью программ Genemapper v3.7 (Applied Biosystems), Bioedit (Hall, 1999) и GENECAP (WilBerg, Dreher, 2004). Оценка уровня полиморфизма проведена по методу Ботштейна (Botstein et al., 1980).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Более половины образцов (72.61%) идентифицировано по последовательностям гена цитохрома b длиной около 450 н.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.