ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 430, № 6, с. 847-849
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.17:599.73
НЕИНВАЗИВНЫИ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ ГИПОТАЛЛАМУС-ГИПОФИЗ-НАДПОЧЕЧНИК
АМУРСКИХ ТИГРОВ
© 2010 г. В. В. Рожнов, В. С. Лукаревский, Х. А. Эрнандес-Бланко, П. А. Сорокин, М. Н. Литвинов, А. К. Котляр, В. Г. Юдин, С. В. Найденко
Представлено академиком Д.С. Павловым 22.10.2009 г. Поступило 23.10.2009 г.
Оценка состояния животных в природных популяциях зачастую возможна только с использованием неинвазивных методов. Использование антител к кортикостерону для иммуноферментного анализа позволяет выявить подъем концентрации иммунореактивных веществ, связывающихся с антителами к кортикостерону, в экскрементах тигров как после искусственной стимуляции надпочечников инъекцией адренокортикотропного гормона, так и после стрессирующего воздействия (транспортировки животных). Это подтверждает возможность использования антител к кортико-стерону для неинвазивного мониторинга состояния гипоталламо-гипофизарно-надпочечнико-вой системы (ГГНС) у амурских тигров.
Амурский тигр (Panthera tigris altaica) — подвид, обитающий на краю видового ареала в субоптимальных для вида условиях, при которых негативное воздействие отдельных факторов с большей вероятностью может вести к увеличению активности ГГНС и в результате — к подавлению размножения и даже к гибели животных. Реабилитация тигров, изъятых из природы, и последующее возвращение их в естественные условия становятся актуальным способом сохранения вида, однако эти действия сопряжены с транспортировкой животных, являющейся сильным стрес-сирующим фактором. Учитывая, что численность амурского тигра невысока (около 500 особей [1]), знание факторов, представляющих угрозу для выживания этого вида, а также определение воздей-
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской Академии наук, Москва Государственный природный заповедник "Уссурийский" им. В.Л. Комарова Дальневосточного отделения Российской Академии наук, Уссурийск Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской Академии наук, Владивосток
ствия транспортировки на уровень стрессирован-ности животных чрезвычайно важны для сохранения амурского тигра и разработки программ реабилитации этих животных.
Оценка благополучия (welfare) животных проводится в первую очередь по степени активности ГГНС, поскольку неблагоприятные воздействия ведут к ее увеличению и повышению уровня глю-кокортикоидов в плазме крови. Оценка изменений концентрации глюкокортикоидов (в первую очередь кортизола и кортикостерона) в плазме крови в сравнении с базальным уровнем может служить надежным индикатором состояния животных. Вместе с тем этот метод имеет серьезные ограничения: такие стрессирующие процедуры, как отлов животных, хендлинг или обездвиживание сами по себе зачастую ведут к резкому увеличению уровня глюкокортикоидов в плазме крови животных, что приводит к значительному искажению результатов, так как в этом случае фактически регистрируется ответная реакция на проводимые процедуры [2].
Альтернативным подходом к оценке активности ГГНС является оценка концентрации гормонов и их метаболитов в экскретах животных, в первую очередь в их моче и экскрементах [3]. Однако в этом случае необходимо принимать во внимание видовые особенности метаболизма стероидных гормонов, который может быть различен даже у близкородственных видов. Для представителей семейства кошачьих при неинвазив-ной оценке гормонального статуса животных наиболее часто применяют методы радиоимунно-го анализа (РИА) с использованием антител к кортикостерону [3, 4] или иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител к 11,17-диоксиандростанам (11,17-ДОА) [5] или к кортизолу [6, 7]. В отличие от РИА на кошачьих практически не используется ИФА с применением антител к кортикостерону.
Целью настоящего исследования было изучить возможность использования антител к кортикосте-
848
РОЖНОВ и др.
ИРВ-кортикостерон, нг/г 80 г 70 60 50 40 30 20 10 0
ИРВ-кортикостерон, нг/г
-2-10 1 2 Сутки
50 102
45 102
40 102
35 102
30 102
25 102
20 102
15 102
10 102
5 102
0
Транспортировка
1
H_I__I_■Ш_I_■Ш_I-
3 0 2 4 6 Сутки
Рис. 1. Уровень ИРВ-кортикостерона в экскрементах самца тигра до и после инъекции АКТГ. По оси абсцисс показаны сутки до и после инъекции гормона.
Рис. 2. Уровень ИРВ-кортикостерона в экскрементах самки тигра до и после транспортировки. По оси абсцисс — то же, что на рис. 1.
рону для ИФА для оценки активности ГГНС амурских тигров. В связи с этим определяли изменение концентрации иммунореактивных веществ (ИРВ), связывающихся с антителами к кортико-стерону (ИРВ-кортикостерон), после активации ГГНС посредством инъекции адренокортико-тропного гормона (эксперимент 1). Кроме этого, оценивали концентрацию тех же веществ после транспортировки животного (эксперимент 2).
Первый эксперимент проводили в Зоологическом центре Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН в апреле-мае 2008 г. Половозрелому самцу тигра в возрасте 17 лет (примерная масса тела зверя — 200 кг) ввели внутримышечно синтетический аналог АКТГ (Synacten, "Novartis Pharma GmbH", Nürnberg), 1 мг/мл в дозе 1.5 МЕ/кг массы тела. Экскременты тигра собирали ежедневно в течение 8 сут до и после инъекции. После сбора аликвоты экскрементов (около 1—3 г) замораживали, хранили при температуре —18°С и затем в замороженном виде транспортировали на Научно-экспериментальную базу "Черноголовка" Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, где проводили дальнейшие измерения.
Определение уровня стрессированности зверя при транспортировке проводили в августе 2008 г. Была использована взрослая самка тигра (масса тела 120 кг, возраст 7 лет), рожденная в Зоологическом центре БПИ ДВО РАН и содержавшаяся в Зоосаде "Приамурский" им. В.П. Сысоева (г. Хабаровск). Она была обездвижена смесью 0.018 мг/кг медетомидина (Domitor, "Orion Corporation", Финляндия) и 1.79 мг/кг золетила ("Virbac", Франция), после инъекции 0.08 мг/кг атипамезо-ла гидрохлорида (Antisedan, "Orion Corporation", Финляндия) помещена в транспортную клетку, на вертолете в течение трех часов перевезена на место постоянного содержания и помещена в новую клетку, в которой содержалась до окончания
эксперимента. Сбор экскрементов проводили ежедневно в максимально короткий период после их выделения. Хранение и транспортировка образцов были идентичны описанным выше.
Экстракцию стероидных гормонов проводили по стандартной методике [7]. Отобранные аликво-ты экстракта хранили при температуре — 18°С до проведения измерений. Концентрацию иммунореактивных соединений, связывающихся с антителами к кортикостерону, проводили с использованием антител к кортикостерону, полученных из Института исследований в дикой природе и зоопарках (Берлин, Германия). Измерения осуществляли в парных вариантах [7, 8]. В первом эксперименте расчет концентрации гормона проводили на 1 г влажных экскрементов, во втором — на 1 г сухих экскрементов.
После введения синтетического аналога АКТГ уровень ИРВ-кортикостерон в экскрементах самца тигра на следующие сутки вырос почти в три раза и еще сутки оставался увеличенным (рис. 1).
После иммобилизации и транспортировки самки тигра уровень ИРВ-кортикостерона существенно возрос в экскрементах животного, собранных через два дня поле транспортировки при первой дефекации тигра (масса экскрементов не более 10 г), рис. 2. Через четыре дня после транспортировки (при первой нормальной дефекации) уровень ИРВ-кортикостерона был максимален и превышал базальный более чем в 10 раз.
Использование инъекции АКТГ (стимулирование секреции гормонов надпочечников) является широко распространенным методом для оценки валидности неинвазивных методов измерения глюкокортикоидов [3, 4]. При этом обычно эксперимент проводят на 1—2 особях [5]. Увеличение концентрации ИРВ-кортикостерона в экскрементах вскоре после инъекции (это время ви-доспецифично) служит надежным подтверждением валидности используемой методики и
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 430 № 6 2010
НЕИНВАЗИВНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ АКГИВНОСТИ
849
специфических антител. Собственно применение антител к кортикостерону (но для радиоиммунного анализа) широко используется для различных видов кошачьих [3, 4], однако использование нами антител для ИФА значительно упрощает методику анализа образцов.
Введение АКТГ в количестве 2.5 МЕ/кг вызывает увеличение уровня кортизола в среднем в 3—3.5 раза через 1 ч после инъекции у евразийской рыси (Lynx lynx) [9] и дальневосточного лесного кота (Prionailurus bengalensis euptilura) [7]. Введение АКТГ бенгальскому тигру примерно в таком же количестве (250 МЕ на животное, масса тела не указана) приводило к увеличению концентрации корти-зола в плазме крови в 1.7 раза [10]. В нашем случае в эксперименте 1 уровень ИРВ-кортикостерона возрастал в 3.3 раза по сравнению с базальным. Однако, принимая во внимание, что изменения уровня кортизола в плазме крови и его метаболитов в экскрементах не всегда четко соответствуют друг другу, а индивидуальные различия в реактивности животных крайне велики [7], сравнение величины гормонального ответа в плазме крови и экскрементах не всегда корректно.
При транспортировке животного уровень ИРВ-кортикостерона возрастал значительно больше, чем при инъекции АКТГ. По-видимому, доза АКТГ при инъекции была значительно ниже физиологического максимума [10]. Комплексное воздействие различных стресс-факторов (иммобилизация, транспортировка в вертолете при повышенном звуковом фоне, эффект новизны при помещении в транспортную и новую зоопарков-скую клетки) обусловило значительный подъем уровня глюкокортикоидов.
Результаты обоих экспериментов показывают, что изменение уровня ИРВ-кортикостерона отражает изменения в активности ГГНС у тигра, и антитела к кортикостерону (ИФА) могут быть использованы для оценки степени стрессированно-сти амурских тигров в неволе и природе. Это от-
крывает новые перспективы для изучения состояния природных группировок амурских тигров и выявления лимитирующих факторов для этого подвида, а также
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.