ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 200S, № l, с. 24-29
= БИОХИМИЯ
УДК 612.018.2:612.017.12
НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРЯМЫХ И ОПОСРЕДОВАННЫХ ЭФФЕКТОВ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА, КОНТРОЛИРУЮЩЕГО ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ
© 2008 г. С. В. Ширшев, О. Л. Горбунова
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 Пермь, Голева, 13
E-mail: shirshev@iegm.ru Поступила в редакцию 22.02.2007 г.
В экспериментах на мышах-самках породы Swiss изучали влияние хорионического гонадотропина и индуцированного им гормонального фона на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови и перитонеальных макрофагов. Установлено, что in vitro прямое иммунодепрессивное действие хорионического гонадотропина на фагоциты зависит от функционирования Са-каналов L-типа и усиливается дополнительным паракринным контролем со стороны простагландинов. В то время как на системном уровне эффекты хорионического гонадотропина зависят от активации синтеза половых стероидных гормонов, которые нивелируют самостоятельное фагоцит-депрессивное действие хориогонина и формирования адоптивных гуморальных иммунных реакций.
Беременность представляет собой сложный процесс, уникальность которого заключается не только в преодолении трансплантатом (развивающийся плод) иммунных механизмов, но и в становлении новых эндокринных взаимодействий, обеспечивающих на качественно новом уровне нормальное сосуществование и развитие двух организмов. Геном развивающегося плода в организме матери наполовину заимствован у отца (Ширшев, 2002), однако при физиологически протекающей беременности его отторжения не происходит. В исследовании механизмов перестройки иммунной системы в период беременности важную роль играет оценка иммуномодулирую-щей активности гормонов репродукции. Основным гормоном плаценты, протектирующим развитие беременности, является хорионический го-надотропин (ХГ) (Баграмян, 1984; Димитров, 1979). Показано, что ХГ имеет специфические рецепторы на различных типах иммунокомпетент-ных клеток (Lin et al., 1995) и оказывает существенное влияние как на адаптивные, так и на неспецифические защитные реакции организма (Ширшев, Куклина, 2001). Помимо этого, ХГ стимулирует секрецию прогестерона (Pr) и эстрадио-ла (Е2) и свои иммуномодулирующие эффекты реализует в комплексе с этими гормонами, что говорит о частичной опосредованности действия хориогонина (Albrecht, Pepe, 1990). В то же время направленность иммунорегуляторного действия ХГ зависит не только от уровня половых стероидов, но и активационного статуса клетки-мишени (Ширшев, 1993; 1994), важную роль в котором иг-
рают простагландины (ПГ) (Eldanovski, Gield-anovski, 1980).
В период беременности супрессия адаптивного иммунного ответа матери компенсируется активацией системы естественного иммунитета (Abrahams et al., 2004; Alexander et al., 1998). Основными клетками, которые определяют функционирование данной системы, являются моноциты и макрофаги. Во время беременности в матке и де-цидуальной оболочке содержится большое количество макрофагов, численность которых регулируется плацентарными гормонами (Alexander et al., 1998), в частности ХГ, который модулирует их функциональную активность (Feinberg et al., 1994).
Целью данной работы было исследование прямых, а также опосредованных половыми стероидными гормонами и ПГ эффектов ХГ на фагоцитарную активность лейкоцитов крови и перитонеальных макрофагов мышей-самок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на мышах-самках породы Swiss массой 20-22 г. На первом этапе эксперимента оценивали возможный механизм прямого действия ХГ на фагоцитарную активность клеток крови и перитонеальной полости. Для этого изучали действие гормона в краткосрочной культуре клеток перитонеального смыва и периферической крови в стандартных условиях, а также в условиях блокады циклооксигеназы
(ЦОГ) - ключевого фермента синтеза ПГ (Bjorn-son, Detmers, 1995), и Са2+-каналов L-типа.
ХГ (Profasi, Серано, Италия) использовали в дозах 100 и 10 ME/мл, соответствующих его среднему уровню в сыворотке крови беременных женщин в I и II-III триместры соответственно (Димитров, 1979). Для блокады ЦОГ применяли диклофенак натрия (диклонак, Lupin, Индия) в концентрации 0.015 мг/мл (Ширшев, Кеворков, 1993). Са2+-каналы L-типа инактивировали вера-памилом (изоптин, Knoll, Германия) в концентрации 0.025 мг/мл (Ширшев, Кеворков, 1993).
Периферическую кровь получали при декапи-тации интактных мышей-самок с добавлением гепарина (25 ед/мл). Перитонеальные макрофаги выделяли стандартной методикой с использованием среды 199 (Иммунологические методы, 1987). Концентрацию клеток в культуре перито-неальных макрофагов доводили до 2 х 106 кл./мл, а для исследования фагоцитарной активности лейкоцитов использовали цельную кровь. Вся работа проводилась в пластиковых микропробирках с антиадгезивным покрытием.
Цельную периферическую кровь и перитоне-альные макрофаги инкубировали в течение 1 ч в термостате при 37°C в присутствии ХГ и/или ингибиторов, после чего исследовали фагоцитарную активность клеток, внося в каждые аликво-ты формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) в концентрации 108 кл./мл в равных соотношениях (0.1 мл) (Каплин, 1996). Пробы инкубировали 20 мин при 37°C, затем содержимое пробирок ресуспендировали и готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. После микроскопирования мазков рассчитывали: 1) процент фагоцитоза -количество фагоцитирующих лейкоцитов на 300 подсчитанных фагоцитов; 2) индекс фагоцитоза -количество ФЭБ, захваченных одним фагоцитом; 3) фагоцитарное число - количество ФЭБ, которое приходится на один из 300 подсчитанных фагоцитов. Указанные показатели рассчитывали отдельно для моноцитов, нейтрофилов, эозино-филов периферической крови и макрофагов пе-ритонеального смыва.
На втором этапе исследовали системные эффекты ХГ на фагоцитарную активность клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов на фоне внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана в концентрации 108 кл./мышь, которую проводили на 5-е сут от начала инъекций ХГ. Животные были разделены на три группы: двум экспериментальным группам ХГ вводили пятикратно подкожно через день в течение 10 сут в дозах 200 и 20 ME/мышь, соответствующим концентрациям, используемым в эксперименте in vitro (пересчет на объем крови животного). Контрольной группе животных инъецировали официналь-
ный растворитель гормона (0.9%-ный хлорид натрия). Фагоцитарную активность лейкоцитов крови и перитонеальной полости определяли вышеописанным методом (Каплин, 1996).
Для оценки гонадотропного действия ХГ в сыворотке крови мышей определяли уровни E2 (Dia. Metra S.r.l., Италия. KODE: DKO 003, LOT № 10) и Pr (ООО "Хема-Медика", Москва Кат. № К207, FK207 R Версия 03. 2002) иммуноферментным методом. Учет результатов проводили с помощью планшетного анализатора "Bionhit" BP 800 при длине волны 450 нм. Параллельно, на 5-е сут, оценивали титр специфических антител к ЭБ (IgM) в реакции прямой гемагглютинации (Иммунологические методы, 1987). Кроме этого, исследовали эффекты ХГ и индуцированного им стероидного фона на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови и макрофагов перитонеальной полости у неиммунизированных животных.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием U-крите-рия Манна-Уитни и корреляционного анализа по Спирмену.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании непосредственного эффекта ХГ на фагоциты в системе in vitro установлено, что гормон вне зависимости от дозы статистически значимо угнетает количество и поглотительную активность фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов периферической крови, а также макрофагов перитонеальной полости мышей-самок. Данный эффект гормона связан с функционированием как Са2+-каналов L-типа, так и активностью ЦОГ, так как на фоне селективных ингибиторов ХГ утрачивает свое депрессивное действие, а в ряде случаев (ХГ 100 МЕ - нейтрофилы и макрофаги перитонеальной полости; ХГ 10 МЕ - моноциты) меняет его на активирующее (табл. 1). Учитывая, что в макрофагах и нейтрофилах активация ЦОГ приводит к повышению секреции молекул ПГЕ2, которые реализуют свое действие через ЕР2 рецепторы, связанные с аденилатцик-лазой, можно говорить о данной молекуле как вероятном аутокринном кофакторе, усиливающем депрессивный цАМФ-зависимый механизм действия ХГ. Са2+-каналы L-типа также участвуют в потенцирующем действии, усиливая ХГ-депрес-сивный эффект гормона, активируя, по-видимому, аденилатциклазу фагоцитов, что дополняет цАМФ-зависимый гормональный сигнал. В отличие от нейтрофилов и макрофагов, моноциты периферической крови, напротив, повышают свой фагоцитарный потенциал, но только под влиянием высокой дозы ХГ, при этом блокада ЦОГ практически не влияет на это ХГ-активирующее действие. Блокада Са2+-каналов L-типа нивелиру-
Таблица 1. Влияние ХГ на фагоцитарную активность лейкоцитов крови и макрофагов перитонеальной полости
in vitro
Экспериментальное воздействие Процент Индекс Фагоцитарное число
Нейтрофилы
Контроль - среда 199 27.7 ± 1.76 1.21 ± 0.02 0.34 ± 0.02
ХГ 10 МЕ 19.4 ± 1.56 a 1.21 ± 0.03 0.23 ± 0.02
ХГ 100 МЕ 21.1 ± 0.54 a 1.37 ± 0.07 0.29 ± 0.02 a
Диклофенак 27.7 ± 1.54 1.40 ± 0.05 a 0.39 ± 0.03
Диклофенак + ХГ 10 МЕ 27.9 ± 2.39 b 1.45 ± 0.01 a, b 0.39 ± 0.02 b
Диклофенак + ХГ 100 МЕ 33.5 ± 1.91 a, b, c 1.46 ± 0.07 a 0.50 ± 0.05 a, b
Изоптин 26.1 ± 2.08 1.20 ± 0.03 0.31 ± 0.02
Изоптин + ХГ 10 МЕ 33.6 ± 1.17 a, b, c 1.29 ± 0.04 b 0.44 ± 0.03 a, b, c
Изоптин + ХГ 100 МЕ 26.54 ± 6.78 1.23 ± 0.04 0.31 ± 0.07
Моноциты
Контроль - среда 199 37.8 ± 5.06 1.28 ± 0.22 0.48 ± 0.09
ХГ 10 МЕ 51.3 ± 6.08 1.94 ± 0.44 0.98 ± 0.23
ХГ 100 МЕ 60.5 ± 5.65 a 2.07 ± 0.07 1.41 ± 0.02
Диклофенак 40.9 ± 4.79 1.11 ± 0.11 0.43 ± 0.03
Диклофенак + ХГ 10 МЕ 58.5 ± 3.90 a, c 1.36 ± 0.18 0.81 ± 0.14 c
Диклофенак + ХГ 100 МЕ 49.63 ± 6.13 2.47 ± 0.53 c 1.25 ± 0.03 a, c
Изоптин 45.5 ± 4.26 1.00 ± 0.00 0.46 ± 0.04
Изоптин + ХГ 10 МЕ 57.4 ± 5.30 a 1.06 ± 0.06 0.61 ± 0.07
Изоптин + ХГ 100 МЕ 45.74 ± 5.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.