ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2012, том 31, № 6, с. 9-15
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ
УДК 535.37
НЕЛИНЕЙНО-ОПТИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ БЛИЖНЕГО ИК-ДИАПАЗОНА НА МОРФОЛОГИЮ И СТРУКТУРУ НЕРВНОЙ КЛЕТКИ В ПОЛЕ
ОПТИЧЕСКОЙ "ЛОВУШКИ"
© 2012 г. Ю. В. Барбашов1*, А. Д. Залесский1, М. А. Березуцкая2, Г. В. Максимов2, А. Б. Рубин2, О. М. Саркисов1, В. А. Надточенко1, 3
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук, Москва 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 3Институт проблем химической физики Российской академии наук, Черноголовка
*Е-таИ: playa_mipt@yahoo.com Поступила в редакцию 11.10.2011
Изучены изменения морфологии и структуры нервной клетки в процессе манипулирования ею методом оптического лазерного "пинцета" с использованием фемтосекундного лазерного излучения (ФЛИ) с длиной волны около 800 нм. В основе эффекта изменения морфологии и структуры лежат нелинейно-оптическое поглощение света и многофотонное возбуждение биомакромолекул клетки фемтосекундными импульсами. Продемонстрировано разрушение ядра при фокусировке ФЛИ. Установлено изменение состояния цитоплазмы нуклеопротеидов ядра и гидрофобности плазматической мембраны нервной клетки под действием сфокусированного внутри клетки ФЛИ. На примере одновременного перемещения нейрона с помощью непрерывного лазера и разрезания отростка нейрона с помощью ФЛИ рассмотрено использование голографического оптического манипулятора и "скальпеля" с применением лазеров с фемтосекундным и непрерывным излучением. Продемонстрирована возможность одновременного микрохирургического воздействия несколькими оптическими фокусами ФЛИ.
Ключевые слова: лазер с фемтосекундным излучением, нейроны, миелиновое волокно, голографи-ческий манипулятор.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время широкое распространение получили исследования в области оптического манипулирования и микрохирургии клетки, субклеточных структур [1—3]. Основная идея такого рода исследований заключается в использовании сфокусированных лазерных пучков для захвата мезоскопических биообъектов с размером от нескольких нанометров до нескольких микрон оптической "ловушкой". При перемещении фокуса лазерного пучка будет перемещаться и захваченный объект или его фрагмент. Применение фем-тосекундного лазерного излучения (ФЛИ) в технике оптических манипуляторов и "скальпеля" дает ряд преимуществ для решения задач клеточной биологии. Это излучение благодаря высокой плотности мощности при довольно низкой энергии импульса представляет также значительный интерес для применения в биологии, так как низкие энергии импульса уменьшают разогрев изучаемого объекта. Материал клетки, прозрачный для лазерного света при низком световом потоке, поглощает свет в интенсивном поле лазера Е из-за
нелинейно-оптических эффектов, что позволяет разрезать ткань биообъекта, т.е. "ловушка" может использоваться как "наноскальпель" [4]. Высокая интенсивность лазерного поля является благоприятным фактором для использования ФЛИ в качестве "наноскальпеля". Кроме того, многофотонное поглощение позволяет визуализировать биообъект за счет многофотонной флуоресценции с пространственным разрешением выше, чем при линейной однофотонной флуоресценции. Таким образом, оптическим "ловушкам" ФЛИ можно придать многофункциональность — лазерный "пинцет", "наноскальпель" и визуализатор клетки. Функция "наноскальпель" открывает возможности для развития нанонейрохирургии. Очевидно, что данный метод позволит проводить микрохирургические операции на отдельном волокне в составе целого нерва, детектировать и дифференцировать поступающие по нерву импульсы (оптический нерв), выявить вектор аф-ферентности волокон (нервный ствол позвоночника), а также, главным образом, исследовать механизм повышенной возбудимости нервного
волокна, возникающей при механической и других травмах нервной системы. В последнем случае исследование воздействия лазерного излучения должно быть совмещено с флуоресцентной индикацией ионных каналов аксолеммы (Ма-ка-нала, К-канал, Са-канал), а также состояния миелина и аксоплазматического транспорта. Лазерный "пинцет" может использоваться для исследования цитоскелета, измерения вязкости и упругости биополимеров клетки. К настоящему времени практически нет исследований об изменении функционального состояния нервной клетки в поле оптической "ловушки".
Цель работы заключалась в исследовании воздействия ФЛИ при различных уровнях мощности и экспозиции излучения на морфологию клетки и структуру ряда клеточных органелл (ядро, плазматическая мембрана) нервной клетки (нейрон и миелиновое нервное волокно).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. В качестве объекта исследования использовали миелиновые нервные волокна лягушки и нейроны, выделенные из ганлглиев медицинской пиявки [5]. Для визуализации динамики процессов, происходящих после воздействия фемтосекундного лазерного излучения, использовались две пары красителей: 1-анилино-нафталин-8-сульфонат (АНС) и n-толуолсульфо-нат 4-(я-диметиламиностирил)-1-гексилпириди-ния (ДСП-12), флуоресцеиндиацетат (ФДА) и этидиум бромид (ЭБ).
Приготовление препаратов. Растворы и реактивы. Объектом исследования была медицинская пиявка Hirudo medicinalis. Экспериментальных животных содержали при температуре +4°С в чистой воде. Пиявку анестезировали (замораживали). Далее объект вскрывали с брюшной стороны, раздвигали мышцы и соединительнотканную капсулу и вырезали нервную цепочку. Затем очищали цепочку ганглиев от сосудистой оболочки. Для выделения отдельного ганглия перерезали кон-нективы, которые соединяют ганглий с остальной цепочкой. Все операции проводились в нормальном растворе Рингера (115 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1.8 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH-7.4, 10°С). Эксперименты проводились при комнатной температуре (20°С). Изолированные ганглии фиксировали вентральной стороной вверх. Из отдельного ганглия выделяли нейроны и помещали на покровное стекло. Далее на покровное стекло добавляли зонды. Для первой серии экспериментов: 1) 1 мкл 0.5 мМ АНС (в H2O) на 50 мкл раствора Рингера; 2) 1 мкл 1 мМ ДСП-12 (в этаноле) на 50 мкл раствора Рингера. Для второй серии: 1) 10 мкл этидиум бромида (0.5 мг/мл) на 1 мл
раствора Рингера; 2) 1 мкл флуоресцеиндиацетат (5 мг/мл) на 1 мл раствора Рингера.
Принцип действия оптического манипулятора. Оптический манипулятор основан на оптическом захвате объекта. Описание физического механизма захвата зависит от отношения размера частицы и длины волны излучения [6]. Существует два предельных случая: 1) частица много меньше длины волны и 2) частица много больше длины волны.
В первом случае полагают, что частица в фокусе объектива под действием лазерного излучения становится однородно поляризованной, и далее ее рассматривают как точечный диполь. На частицу подобного типа в общем случае действуют силы, обусловленные поглощением, рассеянием света, а также градиентом интенсивности излучения. Поведение прозрачных частиц, размеры которых много больше длины волны падающего излучения, может быть описано классическими теориями преломления и отражения. Свет, преломляясь внутри объекта, оказывает на него воздействие. При этом при отклонении объекта от положения равновесия в потенциальном поле оптической "ловушки" поле излучения создает силу, направленную к фокусу излучения. При достаточно сильном поле излучения частице трудно изменить положение вблизи фокуса. Следует отметить, что положение "ловушки" будет смещено относительно точки фокусировки силами, возникающими при отражении света от поверхности шарика. В промежуточном режиме, когда длина волны сравнима с размерами частицы, необходимо прибегнуть к полной теории электромагнетизма и при этом учитывать, что амплитуда поля переменна вдоль частицы.
Принцип работы голографического оптического манипулятора. Голографический оптический манипулятор является усовершенствованным вариантом оптического манипулятора. Основная идея его работы заключается в использовании пространственного оптического модулятора (ПОМ), который представляет собой зеркальную жидкокристаллическую матрицу [7]. Принцип ее работы состоит в том, что каждый элемент этой матрицы можно запрограммировать на определенную фазовую задержку лазерного излучения. После того как лазерный луч отражается от такого модулятора, изначально плоский фронт лазерного излучения преобразуется. Далее этот преобразованный луч проходит через линзу объектива и фокусируется в заранее запрограммированную трехмерную "картинку". Таким образом, мы можем получить уже не одну "ловушку", а множество независимо и трехмерно управляемых ловушек, программируя модулятор на фокусирование луча в соответствующее количество точек. Количество "ловушек" ограничивается параметрами модулятора (предельная мощность падающего
и
Рис. 1. Последовательные кадры видеозаписи, полученной в ходе работы: кадр 1 — начальное положение нейрона, стрелкой указано место воздействия фемтосекундного лазера, кружком выделено место воздействия ФЛИ; кадр 2 — смещение нейрона вниз; кадр 3 — смещение нейрона влево.
излучения, физические размеры жидкокристаллического зеркала).
Установка. Схема установки подробно описана и представлена на рис. 2 в работе [9]. В данной работе диаметр получаемой в фокальной плоскости лазерной перетяжки составлял 0.6 мкм и 0.8 мкм соответственно для лазеров с непрерывным и фемтосекундным излучением. Флуоресценция образца детектировалась на CCD-камеру Апёога. Измерение длительности оптических ловушек на предметном столике микроскопа осуществлялось при помощи автокоррелятора Ауе8-1а. В работе использовалось разработанное нами программное обеспечение, позволяющее создавать и перемещать множество оптических ловушек в трехмерном пространстве одновременно как для фемтосекундного, так и для непрерывного излучений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оптическое манипулирование
В ходе выполнения настоящей работы нами были проведены эксперименты по выявлению возможности манипуляций отдельными нейронами с помощью непрерывного лазера. На рис. 1 показан процесс лазерного микрох
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.