БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 1, с. 22 - 31
УДК 577.24
НЕСКОЛЬКО ФАКТОРОВ ВОВЛЕЧЕНЫ В УЗНАВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ
Обзор © 2011 г. К. Сугасава
Biosignal Research Center, Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University, 1-1 Rokkodai, Nada-ku, Kobe, Hyogo 657-8501, Japan;fax: (+81)78-803-5970, E-mail: ksugasawa@garnet.kobe-u.ac.jp
Поступила в редакцию 14.09.10 После доработки 05.10.10
Эксцизионная репарация нуклеотидов — один из путей защиты генома высших эукариот, отличающийся широким субстратным разнообразием, — способна удалять множество повреждений, дестабилизирующих ДНК-дуплекс. Эта система репарации предотвращает остановку репликации ДНК на повреждении, препятствуя возникновению мутаций и канцерогенеза. Таким образом, вопрос о том, как происходит проверка огромного генома на наличие небольшого числа повреждений, имеет фундаментальное значение. Недавние исследования показали, что эта сложная задача решается, по-видимому, путем последовательных действий нескольких факторов, узнающих повреждение ДНК, включая UV-DDB, XPC и TFIIH. Следует отметить, что все эти факторы характеризуются абсолютно разными способами узнавания повреждения в ДНК. Белок XPC определяет нарушение комплементарности в парах оснований и/или их дестабилизацию, что обеспечивает широкий спектр субстратной специфичности этого процесса репарации. UV-DDB узнает непосредственно определенный тип повреждений, таких как УФ-индуцированные фотопродукты, привлекая к ним XPC, что дополнительно расширяет субстратную специфичность. После связывания с ДНК XPC происходит сканирование цепи ДНК на наличие химической модификации с помощью геликазной активности, ассоциированной с TFIIH. Комбинация этих различных стадий узнавания повреждения должна иметь ключевое значение в достижении одновременно эффективности, точности и универсальности всей системы репарации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксцизионная репарация нуклеотидов, узнавание повреждения ДНК, пигментная ксеродерма, XPC, UV-DDB, TFIIH.
Геномная ДНК крайне чувствительна к повреждениям, вызванным ее внутренней нестабильностью, факторами эндогенного происхождения, такими как активные формы кислорода, а также генотоксическими агентами окружающей среды, например радиацией или химическими соединениями. Повреждения ДНК могут
Принятые сокращения: NER — эксцизионная репарация нуклеотидов; CPD — циклобутанпиримидиновые димеры; 6-4PP — пиримидин-пиримидон-(6-4)-фотопро-дукты; XP — пигментная ксеродерма; CS — синдром Кок-кейна; TTD — трихотиодистрофия; RPA — репликативный белок A; RFC — репликативный фактор C; PCNA — ядерный антиген пролиферирующих клеток; AAF — #-ацетил-2-аминофлуорен; TGD — трансглутаменазагомологичный домен; BHD — Р-шпилечный домен; UV-DDB — комплекс, состоящий из двух субъединиц (DDB1 и DDB2); АР-сайты — апуриновые/апиримидиновые сайты.
вызывать нарушение основных процессов, протекающих в ядре клетки, включая репликацию и транскрипцию, что ведет к мутациям, хромосомным изменениям, апоптозу клеток и т.д. Эти опасные последствия повреждений ДНК становятся причиной различных патологий человека, таких как рак, неврологическая дегенерация и прогерия. Для противостояния этим неблагоприятным последствиям организмы выработали в ходе эволюции разнообразные пути репарации [1].
Эксцизионная репарация нуклеотидов (МЕЯ) — один из наиболее универсальных путей репарации ДНК, с помощью которого происходит удаление широкого спектра повреждений, дестабилизирующих ДНК-спираль. К субстратам МЕЯ относятся индуцированные УФ-светом дипири-мидиновые фотоповреждения, т.е. циклобутанпиримидиновые димеры (СРВ) и пиримидин-
пиримидон-(6-4)-фотопродукты (6-4PP), а также внутрицепочечные сшивки и объемные ад-дукты оснований ДНК с некоторыми химическими соединениями [2]. Отметим, что все эти повреждения не имеют общей химической структуры. У человека наследственные дефекты NER ассоциированы с некоторыми аутосомны-ми рецессивными нарушениями, такими как пигментная ксеродерма (XP), синдром Коккей-на (CS) и трихотиодистрофия (TTD). К настоящему времени идентифицированы десять NER-дефицитных генетических комлементационных групп (от XP-A до XP-G; CS-A и CS-B; TTD-A) и все отвечающие им гены клонированы [3]. Сейчас известно, что кодируемые этими генами белковые продукты являются компонентами молекулярной машины NER.
В целом первоначальное узнавание повреждения ДНК — ключевое событие, определяющее весь процесс репарации. Однако остается непонятным, каким образом клетка постоянно инспектирует огромный геном, чтобы обнаружить и удалить небольшое число повреждений. В данном обзоре рассматриваются белковые факторы и молекулярные механизмы, лежащие в основе узнавания повреждений в геномной ДНК системой NER у высших эукариот.
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ NER У ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ
Описаны два пути NER у высших эукариот: общая геномная репарация (GG-NER) — путь, по которому идет репарация повреждений во всей геномной ДНК, — и репарация, связанная с транскрипцией (TC-NER) и специализирующаяся на удалении повреждений из транскрибируемой цепи транскрипционно-активных генов (схема 1, см. цветную вклейку). Эти два пути NER различаются на стадии узнавания повреждения. Считается, что в TC-NER сигналом к запуску репарации служит задержка элонгирующей РНК-поли-меразы II на повреждении в матричной цепи ДНК [4, 5]. Для этого процесса, в частности, требуются два продукта генов CS — белки CSA и CSB [6, 7]. В то же время узнавание повреждения в GG-NER зависит от белковых факторов, обладающих способностью специфически связываться с поврежденными участками ДНК. Для инициации процесса GG-NER у высших эукариот необходимо, чтобы с поврежденной ДНК связался комплекс XPC [8—10]. Кроме того, узнавание определенного типа повреждений XPC происходит, по-видимому, при участии белка, связывающего УФ-поврежденную ДНК (UV-damaged DNA-binding protein (UV-DDB)) [11-13].
Несмотря на различные молекулярные механизмы, лежащие в основе детекции повреждения, последующие стадии обоих путей NER определяются одинаковым набором белковых факторов. Один из ключевых факторов (фактор транскрипции H II (TFIIH)) — полифункциональный белковый комплекс, необходимый не только для NER, но и для инициации транскрипции. Две из десяти субъединиц TFIIH, XPB и XPD, обладают геликазной активностью [14, 15], с помощью которой происходит локальное раскручивание ДНК-дуплекса вокруг повреждения. ДНК в частично открытом состоянии стабилизируется за счет сборки других факторов, таких как XPA, XPG и репликатив-ный белок A (RPA) [16—18]. Таким образом, происходит «демаркация» поврежденного участка ДНК перед двойным разрезанием структурно-специфичными эндонуклеазами ERCC1-XPF и XPG [19—21]. После удаления поврежденного фрагмента ДНК длиной 24—29 нуклеоти-дов образовавшаяся одноцепочечная брешь застраивается в процессе ресинтеза ДНК. Этот процесс был успешно реконструирован in vitro с помощью ДНК-полимераз 8 или s (Pol S/s) в присутствии фактора их процессивности, ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), и необходимого для его загрузки на ДНК А1Газ-ного комплекса — репликативного фактора C (RFC) [22, 23]. Кроме того, предполагается участие в этом процессе других ДНК-полиме-раз, например Pol к [24, 25]. Окончательное восстановление цепи ДНК происходит с участием ДНК-лигазы I или комплекса XRCO/ДНК-ли-газа III [23, 26, 27].
КОМПЛЕКС XPC - УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ДЕТЕКТОР ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК
Ген XPC человека кодирует основной белок (расчетное значение pI ~9,03) молекулярной массой 106 кДа, состоящий из 940 аминокислот. Белок XPC существует in vivo в виде стабильного гетеротримерного комплекса, включающего в себя один из двух гомологов белка Saccharomyces cerevisiae Rad23p (RAD23A или RAD23B) и цент-рин-2, известный также как ключевой компонент центросомы [28—30]. Взаимодействие с RAD23 заметно стабилизирует белок XPC как in vitro, так и in vivo, что важно для поддержания активности GG-NER в клетке [31—34]. Во всех тестированных до сих пор клеточных линиях человека уровень экспрессии RAD23B всегда значительно выше уровня экспрессии RAD23A, тогда как в общем эти белки присутствуют в клетке в большом избытке по отношению к XPC
(~20-кратном) [33, 34]. Оба белка RAD23 примерно одинаково связываются с XPC in vitro, тогда как in vivo XPC связан в основном с RAD23B, а не с RAD23A, что, вероятно, отражает разницу в уровнях этих белков [35, 36]. Цент-рин-2 — небольшой кальцийсвязывающий белок, который относится к суперсемейству каль-модулина и содержит четыре консервативных мотива EF-hand. a-Спираль и С-концевой домен XPC идентифицированы как участки, связывающие центрин-2 за счет гидрофобных взаимодействий [37—39]. Хотя центрин-2 необязателен для реконструирования реакции NER в бесклеточной системе, он существенно усиливает ДНК-связывающую активность комплекса XPC и его способность узнавать повреждение.
Очищенный комплекс XPC способен специфически связывать ДНК-дуплексы, содержащие различные повреждения: например, УФ-индуцированные 6-4PP, модифицированные остатки гуанина с присоединенным ^-ацетил-2-аминофлуореном (AAF) и синтетические остатки холестерина [9, 40, 41]. Все эти повреждения полностью отличаются одно от другого по химической структуре, но тем не менее выщипля-ются комплексом NER in vitro. Специфическое связывание продемонстрировано традиционными методами, такими как изменение элект-рофоретической подвижности в геле и ДНКаз-ный футпринтинг, а также обнаружено прямым наблюдением с помощью атомной силовой микроскопии. Дальнейшие всесторонние биохимические исследования в итоге выявили, что комплекс XPC узнает не само по себе повреждение в ДНК, а определенные специфические ДНК-структуры, содержащие переход между двуцепочечной ДНК и 3'-выступающим одно-цепочечным участком [42].
Предполагаемая модель взаимодействия XPC—ДНК, вытекающая из биохимических данных, недавно была подтверждена результатами рентгеноструктурного анализа комплекса гомолога XPC, белка Rad4 из S. cerevisiae, с ДНК-дуплексом, содержащим сайтспецифичное повреждение (УФ-индуцируемый
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.