УДК 577.217
НЕСВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С 5S рРНК МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ БЕЛКА L25 Escherichia coli ЭФФЕКТИВНО ВСТРАИВАЮТСЯ В РИБОСОМУ in vivo*
© 2014 А.Ю. Аникаев1, А.П. Корепанов1, А.В. Коробейникова1, В.Г. Кляшторный1, В. Пиндл2, С.В. Никонов1, М.Б. Гарбер1, Г.М. Гонгадзе1**
1 Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 4; факс: (495)514-0218, электронная почта: gongadze@vega.protres.ru
2 Медицинский университет Инсбрука, Биоцентр, Отдел медицинской биохимии, 6020 Инсбрук, Австрия; факс: +43 512 9003-73110
Поступила в редакцию 23.04.14 После доработки 17.05.14
5S рРНК-связывающиеся рибосомные белки семейства L25 являются эволюционным приобретением бактерий. Ранее нами было показано, что 1) одиночные замены в РНК-связывающем модуле белка данного семейства приводят к дестабилизации комплекса с 5S рРНК или к невозможности его образования in vitro; 2) AL25 рибосомы Escherichia coli менее эффективны в синтезе белка in vivo, чем контрольные рибосомы. В настоящей работе исследована эффективность встраивания белка L25 E. coli с мутациями в 5S рРНК-свя-зывающем участке в рибосому in vivo. Показано, что мутации в белке L25, лишающие его способности связываться со свободной 5S рРНК, не препятствуют эффективному и правильному встраиванию белка в рибосому. Об этом свидетельствует то, что присутствие даже очень слабо удерживающегося мутантного белка L25 в рибосоме положительно влияет на активность аппарата трансляции in vivo. Это указывает на существование альтернативного пути встраивания данного белка в рибосому, исключающего предварительное образование комплекса с 5S рРНК. В то же время, стабильный контакт с 5S рРНК оказывается очень важен для удержания белка L25 в рибосоме, и в этом ключевую роль играют консервативные остатки РНК-связы-вающего модуля белка.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: 5S рРНК-связывающий белок L25, РНК-белковые взаимодействия, рибосома, трансляция, Escherichia coli.
За пятьдесят лет исследований рибосом накоплена обширнейшая информация об их структуре и функционировании. Значительный вклад в это внесли недавние кристаллографические исследования бактериальных рибосом и их функциональных комплексов [1—8]. Однако роль отдельных рибосомных белков и их межмолекулярных контактов в функционировании аппарата трансляции еще мало изучена. Понимание их роли дополнительно осложняется эволюцией структуры рибосомы. Так, рибосомы современных организмов содержат 60—80 разных рибосомных белков, и только 34 из них консервативны во всех доменах жизни [9]. Остальные рибосомные белки являются эволюци-
* Приложение опубликовано на сайте «Biochemistry» (Moscow), Vol. 79, issue 8, 2014.
** Адресат для корреспонденции.
онным приобретением архей, бактерий или эука-риот.
Рибосомный белок L25 E. coli и его гомологи, семейство белков L25 [10], являются структурной особенностью бактериального аппарата трансляции. Белок L25, взаимодействуя с 5S рРНК, занимает обособленное положение в центральном протуберанце 50S рибосомной субчастицы [2, 11]. Показано, что уникальная по своей структуре Е-петля бактериальной 5S рРНК (рис. 1, а) является местом специфического связывания белков семейства L25, как в изолированном комплексе, так и в рибосоме [1—3, 12—19]. Эволюционная консервативность данного РНК-белкового контакта была продемонстрирована в структурных исследованиях комплексов 5S рРНК с некоторыми представителями семейства, L25 E. coli, TL5 Thermus thermophilus и CTC Deinococcus radiodurans [1—3, 15—17]. Обра-
а
б
в
Рис. 1. Взаимодействие белка L25 с 5S рРНК. а — Схема вторичной структуры 5S рРНК E. coli (серым цветом отмечен участок связывания белка L25). Слева представлен фрагмент РНК, использованный в работе. Внесенные при транскрипции дополнительные нуклеотиды на З'-конец фрагмента, отмечены серым цветом. б — Область контакта белка L25 с РНК (отмечена серым цветом). Положение консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков, образующих с РНК водородные связи, указано прямоугольниками и овалами, соответственно. Положение остатков S17 и I29 отмечено пятиугольниками. в — Модель данного РНК-белкового комплекса с отмеченными межмолекулярными водородными связями, недоступными молекулам воды. Для построения моделей использована структура комплекса E. coli (PDB code 1DFU)
зование комплекса между 5S рРНК и белками семейства L25 вне рибосомы детально изучено нами и другими исследователями [12—21]. Установлено, что пять строго консервативных аминокислотных остатков (рис. 1, б и в) (два аргинина, тирозин, гистидин и аспарагиновая кислота) формируют 5S рРНК-связывающий модуль в этих белках [16, 17, 19, 21]. В то же время о роли белка семейства L25 и его контакта с 5S рРНК в образовании и функционировании бактериальной рибосомы in vivo до сих пор ничего не известно. Имеются только некоторые косвенные данные, указывающие на их функциональную важность. С одной стороны, способность белков семейства L25 образовывать прочный комплекс с 5S рРНК in vitro [12—21] может указывать на то, что формирование этого комплекса должно предшествовать его встраиванию в рибосому в бактериальной клетке. В подтверждение этой мысли мы недавно показали, что 5S рРНК-бел-ковый комплекс может формироваться в клетках E. coli независимо от его встраивания в рибосому [22]. С другой стороны, один из представителей семейства, белок СТС Bacillus subtilis, является временно ассоциирующим с рибосомой, так как синтезируется в клетке только при стрессовых ситуациях и при этом обнаруживается в рибосоме [23, 24]. В настоящей работе нами показано, что мутантный белок L25 E. coli, не связывающийся со свободной 5S рРНК, способен правильно встраиваться в рибосому in vivo, повышая тем самым эффективность работы бактериального аппарата трансляции.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы, плазмиды и микробиологические методы. В работе использованы стандартные микробиологические подходы, описанные в работе [25]. Ростовые характеристики, а также активность аппарата трансляции клеток каждого штамма оценивали по результатам 3—4 независимых экспериментов. Каждое измерение проводили трижды, относительная ошибка измерений не превышала 5—7%. Штаммы и плазмиды, использованные или полученные в работе, представлены в табл. S1 (см. Приложение). Использованные олигонуклеотиды перечислены в табл. S2 (см. Приложение). Клетки E. coli выращивали при подходящей температуре в среде LB, при необходимости содержащей 50 мкг/мл канамицина или ампициллина. Штамм E. coli XL1-Blue («Stratagene», США) использовали для амплификации плазмидной ДНК.
Получение конструкций, кодирующих мутант-ные формы белка L25. Направленный мутагенез
гена белка L25 (rplY) осуществляли согласно протоколу QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit («Stratagene»). При введении одиночных замен матрицей в ПЦР была плазмида pKAB101 [26], несущая ген rplY дикого типа. Введение нескольких замен проводили последовательно. Праймеры, использованные для мутагенеза, были названы L25-X-F и L25-X-R, где X — соответствующая мутация.
Внесение точечных мутаций в хромосомный ген белка L25. Направленные изменения в хромосому E. coli вносили с помощью метода «recombineering» [27]. Сначала с помощью ПЦР с использованием KOD Hot Start ДНК полиме-разы («Novagen», США) в два этапа получали ДНК-кассету, которая содержала открытую рамку считывания (ОРС) гена rplY или его мутант-ную форму, спейсер из 61 п.н. и ОРС бета-лакта-мазы (bla), а также короткие (~40 нуклеотидов) последовательности на 5'- и З'-концах, гомологичные участкам, примыкающим к гену rplY в хромосоме, и необходимые для последующей рекомбинации. На первом этапе амплифициро-вали ОРС гена rplY или его мутантной формы. Матрицей в ПЦР была плазмида pKAB101 или ее производные (табл. S1, Приложение). В качестве прямого праймера использовали AK22; обратным праймером служил AK23 или rplY-D90Y-rec-R (табл. S2, Приложение). На втором этапе амплифицировали участок плазмиды pBR322 [28], включающий ОРС bla и примыкающую к ней с 5'-конца последовательность длиной 61 п.н. В качестве прямого праймера (F) использовали ПЦР-продукт, полученный в предыдущей реакции; обратным праймером (R) был AK21 (табл. S2, Приложение). Полученные ДНК-кассеты вставляли в хромосому клеток штамма DY330 [27]. Селекцию проводили на чашках с LB-агаром в присутствии ампициллина. Проверку и секвенирование rplY локуса делали с помощью ПЦР с праймерами rplY-check-F и rplY-check-R. После этого мутантные аллели переносили в хромосому штамма W3110 [29] методом общей трансдукции бактериофагом Р1 как описано в работе [30]. В качестве контроля во всех экспериментах был использован штамм MS23, содержащий аллель rplY-1::bla (ОРС rplY дикого типа).
Выделение рибосом и анализ рибосомных белков. Рибосомы из клеток контрольных и исследуемых штаммов выделяли согласно опубликованным методикам [31, 32] с модификациями, описанными в работе [26]. Препараты «неочищенных» рибосом были получены из грубого клеточного экстракта S30 центрифугированием при 380 000 g и 4° в течение 1,5 ч (буфер A (10 мМ Tris-На, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 3 мМ 2-меркап-
тоэтанол, 0,2 мМ ЭДТА) со 100 мМ NH4Cl). Препараты «очищенных» рибосом получали центрифугированием грубого клеточного экстракта S30 при 380 000 g и 4° в течение 3 ч через 30% (w/w) сахарозу, приготовленную на буфере A с 500 мМ NH4Cl. В обоих случаях осадки рибосом растворяли в буфере A со 100 мМ NH4Cl и 10%-ным глицерином, и хранили при —70°. Для анализа белкового состава рибосом использовали двумерный гель-электрофорез (систему IV) как описано в работе [33].
Исследование РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса. Препараты белков L25 и TL5 и их мутантных форм получали как описано ранее [19]. 5S рРНК из клеток E. coli была выделена по описанной ранее методике [21]. Для получения плазмиды pUC18/Eco5Sfr, кодирующей фрагмент 5S рРНК (нуклеотиды 69—106) (рис. 1, а), соответствующий участок гена 5S рРНК E. coli амплифициро-вали с помощью ПЦР с праймерами Fr5S-F и Fr5S-R (табл. S2, Приложение) и клонировали в вектор pUC18 («USBiological», США) по сайтам Nde I and Xba I. Для получения фрагме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.