научная статья по теме НЕЙРОГЕНЕЗ И НЕЙРОАПОПТОЗ В РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ЗРЕЛОГО МОЗГА КРЫС WISTAR Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «НЕЙРОГЕНЕЗ И НЕЙРОАПОПТОЗ В РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ЗРЕЛОГО МОЗГА КРЫС WISTAR»

НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 206-212

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.152

НЕЙРОГЕНЕЗ И НЕЙРОАПОПТОЗ В РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ЗРЕЛОГО МОЗГА КРЫС WISTAR

© 2012 г. В. В. Шерстнев, О. Н. Голубева, М. А. Грудень*, З. И. Сторожева, Е. В. Гусева

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва

Исследованы особенности нейрогенеза в различных отделах головного мозга, ассоциированных с механизмами обучения и памяти у взрослых крыс ^^аг. На срезах головного мозга с помощью метода иммунофлюоресценции в зубчатой фасции и полях СА1—СА4 гиппокампа, различных зонах церебральной коры и черве мозжечка определяли число позитивно окрашенных на ВгёИ (маркер пролиферации клеток) клеток через 24 ч, 15 и 30 сут после его введения. Используя двойное окрашивание в указанных структурах мозга и временных точках, проводили подсчет численности вновь образованных клеток, которые экспрессируют нейрональный (№иК) или астроцитарный (ОАБР), а также апоптотический (ЛроБМЛ) маркеры. Обнаружено, что во всех изученных отделах мозга образуются клетки, которые дифференцируются в нейроны и астроциты, при этом имеются значимые региональные различия выраженности и динамики пролиферации, дифференцировки и апоптоти-ческой гибели вновь образованных клеток. Обсуждаются возможные причины количественных различий между выявленными в работе и полученными ранее другими исследователями показателями нейрогенеза/нейроапоптоза у взрослых крыс ^^аг.

Ключевые слова: нейрогенез, нейроапоптоз, бромдезоксиуридин, зрелый мозг, гиппокамп, кора мозга, мозжечок, крысы Wistar.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время не вызывает сомнения, что сопряженные процессы неонейрогенеза (пролиферация, миграция и дифференцировка нервных и глиальных клеток в зрелом мозге) и нейроапо-птоза (программируемой гибель нейронов и глии) постоянно протекают в нервной системе человека и животных. В головном мозге взрослых млекопитающих наличие нейрогенеза и нейроапоптоза убедительно документировано не только в "классических" пролиферативных зонах — субвентри-кулярной области боковых желудочков и зубчатой фасции гиппокампа, но также в обонятельных луковицах, различных отделах коры мозга и гиппокампа, амигдале, гипоталамусе, септуме, хвостатом ядре, черной субстанции, мозжечке [1—6].

Образование, выживаемость, гибель и созревание новорожденных клеток в зрелом мозге различных видов животных, в частности, крыс и мышей, которые широко используются в экспериментальных исследованиях значительно отличаются по степени выраженности и временной динамике [7]. Животные различных генетических линий характеризуются значимыми отличиями показателей нейрогенеза. Так, установлено, что четыре генетически различные линии мышей отличаются не

*Адресат для корреспонденции: 125009 Москва, ул. Моховая 11, строение 4, тел.: (495) 601-21-30, e-mail: mgruden@mail.ru.

только по интенсивности пролиферации предшественников нейронов и глии в коре мозга и зубчатой фасции гиппокампа, но и динамике диффе-ренцировки новообразованных клеток [8].

Крысы линии ^^аг являются лабораторными животными, которые интенсивно используются в отечественной исследовательской практике в области нейробиологии, онкологии, фармакологии и др. Однако сведения о количественных иммуно-гистохимических показателях процессов нейрогенеза/нейроапоптоза в зрелом мозге интактных крыс ^^аг отсутствуют.

Особый интерес для понимания функциональной роли нейрогенеза представляют результаты исследования особенностей пролиферации и диф-ференцировки вновь образованных клеток в ассоциированных с процессами обучения и памяти церебральных структурах. В первую очередь это отмечено в коре больших полушарий головного мозга, гиппокампе, а также мозжечке, который, согласно современным фактам, вовлечен в обеспечение когнитивных функций [9, 10]. Вместе с тем, опубликованные данные о нейрогенезе у взрослых млекопитающих в мозжечке и зонах гиппокампа помимо зубчатой фасции немногочисленны и противоречивы [11, 12].

Цель настоящей работы — оценка характера неонейрогенеза и нейроапоптоза в структурах головного мозга, участвующих в обеспечении механизмов поведения обучения и памяти (различные

отделы гиппокампа и коры больших полушарий мозга, червь мозжечка) у интактных половозрелых крыс ^^аг. В указанных церебральных структурах, используя маркер пролиферации клеток Бгёи, а также нейрональный, астроцитарный и апоптотический маркеры, иммуногистохимиче-ски определяли общую численность новорожденных клеток, вновь образованных нейронов и аст-роцитов, а также новых клеток, погибающих по типу апоптоза через 24 ч, 15 и 30 дней после введения Бгёи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на крысах-самцах линии ^^аг (п = 15) 13-14-недельного возраста, массой 220—250 г (питомник лабораторных животных "Столбовая" НЦБМ, РАМН) в соответствии с принципами гуманности, изложенными в директиве Европейского сообщества (86/600 ЕС).

Животных содержали по три особи в клетках при постоянной комнатной температуре +22°С и регулярном световом цикле (день 8.00—20.00) в условиях свободного доступа к пище и воде. Время проведения экспериментов с 11.00 до 15.00. Маркер пролиферации клеток 5-бром-2'-дезоксиури-дин (Бгёи) вводили животным внутрибрюшинно 3 раза с интервалом в 30 мин в дозе 50 мг/кг массы тела в 500 мкл 0.9%-ного водного раствора хлорида натрия. Спустя 24 ч, 15 и 30 сут после введения Бгёи животным проводили транскардиальную перфузию раствором 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.4). Мозг извлекали из черепной коробки, замораживали в жидком азоте и хранили при —80°С. В последуюшем готовили фронтальные срезы толщиной 20 мкм на криостате HR 400 (Микром, Германия). Границы анализируемых структур определяли в соответствии с атласом мозга крысы [13]: гиппокамп (от —2.80 мм до —4.30 мм относительно Брегмы), кора больших полушарий мозга, включающая в себя париетальную ассоциативную кору, ретросплениальную кору, вторичную моторную и первичную соматосенсорную кору (от 2.80 до 4.30 мм относительно Брегмы) и червь мозжечка (от —10.52 до —11.6 мм относительно Брегмы).

Общее число срезов мозга одного животного составило: для гиппокампа и коры больших полушарий мозга — п = 75, для червя мозжечка — п = 50. Серийные срезы фиксировали в 4%-ном пара-формальдегиде и подвергали иммунофлюорес-центному окрашиванию клеток для выявления Бгёи, далее последовательному окрашиванию на МеиМ (Бгёи+/МеиМ+), ОБАР (Бгёи+ ОБАР+) и специфические для апоптоза фрагменты ДНК (Бгёи+/АроВМА в следующих структурах мозга: зубчатая фасция гиппокампа, поля СА1—СА4 гип-покампа, кора больших полушарий мозга, расположенная над гиппокампом и червем мозжечка).

Выявление BrdU проводили по методу, описанному в работе Kempermann G. [14], используя мо-ноклональные антитела мыши к BrdU (Sigma, USA). В качестве флюоресцентной метки для выявления BrdU-позитивных клеток использовали краситель Alexa Fluor-488, конъюгированный с козьими IgG против мыши в разведении 1 : 800. С целью определения фенотипа BrdU-позитивных клеток проводили детекцию маркера нейронов — (NeuN, neuron specific nuclear protein) и маркера астроцитов — (GFAP, glial fibrillar acid protein). Для выявления NeuN-позитивных новообразованных клеток в качестве первичных антител использовали моноклональные антитела мыши к NeuN, конъюгированные с биотином (US Biological, USA) в разведении 1 : 100, с последующей обработкой раствором стрептавидина (1 : 100) и окрашиванием срезов конъюгатом флюоресцентного красителя тирамида с антителами кролика к стрептави-дину(Perkin Elmer,USA). Для обнаружения GFAP в BrdU-позитивных клетках применяли метод c использованием в качестве первичных мышиные моноклональные антитела к GFAP (Sigma, USA) в разведении 1 : 100 с последующей обработкой срезов антителами кролика против IgG мыши конъ-югированными с биотином (Perkin Elmer,USA) в разведении 1 : 100. Далее срезы инкубировали в растворе стрептовидина в том же разведении с последующим окрашиванием срезов конъюгатом ти-рамида с антителами кролика к стрептавидину (Perkin Elmer,USA). Для контрастирования ядер использовали смесь DAPI/Antifage Solution (Chemicon, USA). Выявление BrdU-позитивных и BrdU-негативных апоптотических клеток осуществляли по протоколу фирмы-изготовителя, используя два коммерческих набора: ApopTag® Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit и ApopTag Red® In Situ Apoptosis Detertion Kit (Millipore, USA), применение которых основано на детекции специфических фрагментов ДНК, образующихся при апоптотической гибели клеток. Визуализацию окрашенных срезов проводили на микроскопе OLYMPUS BX51-Reflected fluorescence system (Olympus, USA), используя специализированные фильтры - U-MWU2 (Alexa Fluor-350 и DAPI), U-MNB2 (Alexa Fluor-488, Tyramide), а также компьютерную программу обработки информа-цииViewfinder Lite (USA). Подсчет позитивно окрашенных нервных и глиальных клеток проводили на каждом исследованном срезе при увеличении х200. Определяли общее количество меченных маркерами клеток, а также число клеток в 1 мм3 ткани каждой исследованной структуры мозга.

Расчет числа клеток в 1 мм3 нервной ткани проводили по формуле:

, з общее число клеток х 50

1 мм =

S х общее количество срезов где S - площадь структуры.

Количество ВгёИ+/ЛроВМЛ+ клеток в % 35

30 25 20 15 10 5

15

30 Сутки

Рис. 1. Динамика апоптоза новообразованных клеток в структурах мозга половозрелых крыс в различные сроки после введения ВМИ. По оси абсцисс представлены сроки после введения ВМИв сутках. По оси ординат отложено количество Вп!И+/ЛроВКЛ+ клеток в %. Кривые на рисунке соответствуют следующим структурам мозга: 1 — зубчатая извилина гиппокампа; 2 — поля СА1-СА4 гиппокампа, 3 — кора больших полушарий мозга; 4 — червь мозжечка.

В качестве ВгёИ-положительных клеточных элементов подсчитывали клетки с интенсивно окрашенными ядрами, либо имеющие прозрачное ядро с окрашенными глыбчатыми включениями при обязательном наличии видимой четкой границы ядра в плоскости среза. При подсчете клеток с двойным окрашиванием обязательным критерием также являлось наличие отчетливо видимой гран

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»