НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 3, с. 259-264
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8
НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В РОСТРАЛЬНОМ ВЕНТРОМЕДИАЛЬНОМ ЯДРЕ ПРОДОЛГОВАТОГО МОЗГА КРЫСЫ ПРИ РАЗВИТИИ НЕЙРОПАТИЧЕСКОГО БОЛЕВОГО СИНДРОМА © 2015 г. И. В. Манжуло1, 2, *, И. В. Дюйзен1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского
Дальневосточного отделения РАН, Владивосток 2Школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток
Изучена динамика нейрохимических перестроек нейронов вентромедиальной ретикулярной формации продолговатого мозга крысы при развитии нейропатической боли. В составе ядра выявлены отдельные популяции моноаминергических, нитроксидергических проекционных нейронов, а также клетки, метаболизирующие агматин. Изменение их активности при инициации (1 неделя) и становлении (4 неделя) нейропатического болевого процесса демонстрирует фазную динамику. К концу 1 недели регистрируется снижение синтеза катехоламинов, усиление катаболизма агматина и активация наработки NO в нейронах. Через 4 недели после операции, показатели катехоламинергической системы возвращаются к контрольному уровню, значительно снижается нитроксидергическая активность, а катаболизм агматина продолжает нарастать. Результаты исследования свидетельствует о вовлеченности бульбарных NO-ергических, моно- и полиаминергических нейротрансмиттерных механизмов в инициацию и поддержание нейропатического болевого синдрома.
Ключевые слова: NO-синтаза, катехоламины, агматин, вентромедиальная ретикулярная формация, нейропатическая боль.
DOI: 10.7868/S1027813315030073
ВВЕДЕНИЕ
В системной интегративной реакции на боль ядра ретикулярной формации занимают стратегически важное положение, транслируя антиболевые сигналы от среднего и промежуточного мозга к нейронам задних рогов спинного мозга и управляя, таким образом, пропускной активностью "спинальных ворот боли" [1—4]. В настоящее время молекулярные и морфофизиологические основы работы эндогенной антиболевой системы активно исследуются. Ее основным эффектор-ным звеном с прямыми проекциями к локальным и проекционным нейронам поверхностных пластин заднего рога является комплекс ростральных вентромедиальных ядер продолговатого мозга (РВМЯ), расположенный в области большого ядра шва и прилежащей к нему параги-гантоклеточной ретикулярной формации [5]. Работа этого центра модулирует интенсивность восходящего болевого потока, регулирует патологические болевые феномены — термическую и
* Адресат для корреспонденции: 690041, Приморский край, Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17; тел. 8(423) 231-04-63; e-mail: i-manzhulo@bk.ru.
тактильную аллодинию, обеспечивает возможность перехода тонической боли в ее хронический вариант, а также обеспечивает формирование парадоксальных эффектов опиоидных аналгетиков — развитие их про-ноцицептивной активности. Такой широкий спектр биологических эффектов данного ядра связан с особым устройством его локальных и афферентных потоков, что позволяет обеспечивать работу двух диаметрально противоположных механизмов — эндогенной аналгезии и эндогенной про-ноцицепции [6, 7]. Молекулярные, трансмиттерные и рецепторные изменения, происходящие в данном ядре, превращают болевой феномен в динамический процесс, регулирующий не только интенсивность боли, но и ее восприимчивость к проводимой терапии. Считается также, что многие адьювантные аналгетики (анти-конвульсанты, ингибиторы обратного захвата, га-бапентиноиды) в определенной мере имитируют активность именно этой морфофункциональной системы [7]. Несмотря на большие успехи в расшифровке электрофизиологических свойств нейронов РВМЯ, молекулярные и нейротрансмиттер-ные основы реализации эндогенной бульбарной
6
259
модуляции боли до настоящего времени исследованы фрагментарно.
Целью настоящего исследования явилось изучение динамики нейрохимических перестроек в нейронах рострального вентромедиального ядра продолговатого мозга на этапах развития нейро-патического болевого синдрома.
МЕТОДИКА
Характеристика экспериментального материала. Работа выполнена на самцах крыс средним весом 250 г, экспериментальная часть одобрена комиссией по биомедицинской этике Института биологии моря ДВО РАН. Исследование проходило в соответствии с правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Животных содержали в виварии в соответствии с "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник" (от 06.04.1993 г.).
В качестве экспериментального воздействия использовалась модель хронической боли (путем наложения трех тугих шелковых лигатур на седалищный нерв правой задней лапы крысы), которая провоцирует комплекс нейрональных событий, сходных по динамике с нейропатическим болевым синдромом у человека [8]. Развитие болевого синдрома у животных сопровождается появлением ряда патологических симптомов, поддающихся количественной оценке и свидетельствующих об интенсивности боли [9]. Ранее при использовании теста холодной пластины и теста инвалидности, нами была охарактеризована динамика основных болевых феноменов, развивающихся у экспериментальных животных (холодовая алло-диния, спонтанные боли и моторный дефицит) [10]. В этой связи выполняемая в настоящей работе оценка нейрохимических перестроек в мозге животных проводилось в те сроки, которые соответствовали инициации нейропатического болевого синдрома (1 неделя после операции) и его становлению (4 неделя).
Иммуногистохимические методы исследования. Животные были разделены на две группы (п = 21): "контроль" (п = 7) — интактные животные и "боль" (п = 14) — животные с моделью нейропа-тической боли. Животных анестезировали путем внутрибрюшинного введения тиопентала натрия (3%, 60 мг/кг), затем перфузировали 4% раствором параформальдегида приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2). Для оценки ме-диаторного профиля нейронов РВМЯ продолговатого мозга использовали метод иммуноперок-сидазной реакции выявления тирозин-гидрокси-лазы (ТН), нейрональной формы МО-синтазы
(nNOS) и агматиназы — фермента метаболизма аг-матина (AGM). Использованный в работе имму-ногистохимический метод состоит из следующих этапов: фиксация кусочков ткани (4% парафор-мальдегид, приготовленный на 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.2) в течение 12 ч и их последующая промывка; получение серийных криостатных срезов толщиной 50 мкм; прединкубация в растворах, блокирующих эндогенную пероксидаз-ную активность и неспецифическое связывание антител; обработка срезов в растворе первичных антител (4°C, 24 ч); обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции. В работе использованы первичные полик-лональные мышиные и кроличьи антитела против AGM (Sigma-Aldrich SAB1102156, США), TH (Vector Labs T 489, США) и nNOS (Abcam ab40662, США) в разведении 1 : 500, 1 : 30 и 1 : 2000 соответственно. Вторичные антитела, меченные пе-роксидазой хрена (Vector Laboratories, PI-1000 (anti-rabbit); PI-2000 (anti-mouse), 1 : 300) использовались в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для проведения иммуноперокси-дазной реакции использовали хромоген (Thermo scientific, TL-060-QHD, США). После окрашивания срезы тщательно отмывали 0.1 М фосфатным буфером (pH 7.2), обезвоживали и заключали в бальзам по стандартной методике.
Общеморфологические методы исследования. Определение общего количества нейронов в РВМЯ производили при окрашивании по Нисслю. Срезы окрашивали галлоцианин-хромовыми квасцами (0.15% раствор галлоцианина на 5% растворе хромовых квасцов), после чего срезы обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам по стандартной методике. Полученные препараты просматривали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифровой камеры AxioCam ICc3 (Carl Zeiss, Германия).
Количественная обработка данных. Подсчет числа нейронов в ростральном вентромедиаль-ном ядре продолговатого мозга производили в каждом пятом серийном срезе при использовании объектива х12.5, что позволяет получить изображение всего ядра. Учитывали абсолютное количество иммунопозитивных клеток и высчитывали их долю от площади ядра (удельная плотность нейронов в 1 мм3) и от числа нейронов, окрашенных по Нисслю (% содержание). При морфометрии учитывали клетки, имеющие ядро. Морфометрический анализ проводили с использованием пакета программ ImageJ 1.41. Статистическая обработка данных проводилась с использованием one-way ANOVA (пост тест: Tukey) с помощью пакета программ GraphPad Prism 4.00. Результаты считались достоверными прир < 0.05.
Контроль 7 день 28 день
пКОЯ
> Л
.1"
100 мкм
I_I
v
Г
100 мкм
I_I
100 мкм
I_I
А
тн
"' \ л
Ч
л.
.1
'ч
й г
100 мкм д
Уу _
с. " '• «/тЬ
100 мкм „
I_I е
100 мкм
I_I
AGM
ж
* . '
*
100 мкм „
I_I 3
т
*; >
100 мкм
I_I
и
<
100 мкм
I_I
Рис. 1. пКОЯ, ТН и АОМ-позитивные нейроны рострального вентромедиального ядра продолговатого мозга крысы в норме (а, г, ж) и при развитии нейропатической боли на 7 (б, д, з) и 28 (в, е, и) день после перевязки седалищного нерва.
а
в
г
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Нейрональная М0-синтаза. При проведении иммуногистохимической реакции на КО-синтазу в ростральном вентромедиальном ядре маркируются нейроны крупного (30 мкм и более) и среднего (15—30 мкм) размера; их число составляет 16.9 ± 0.5% от окрашенных по Нисслю. Мелкие интернейроны (до 15 мкм) на КО-синтазу не окрашиваются (рис. 1а). Гистохимическая локализация КО-синтазы отчетливо выделяет нейроны РВМЯ от остальных прилежащих сегментов ретикулярной формации, где данный фермент не выявляется. На 7-е сут после перевязки седалищного нерва в группе "боль" в ростральном вентромедиальном ядре количество пКОЯ-позитивных нейронов увеличивается на 26% относительно контрольной группы (451.7 ± 29.9 нейронов в 1 мм3) (рис. 1а, 1б, 2), тогда как к 28-м сут количество пКОЯ-позитивных нейронов уменьшается на 20% по сравнению с интактными животными (рис. 1а, 1в, 2).
Тирозин-гидроксилаза. Иммуногистохимиче-ски в составе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.