ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 1, с. 39-53
МЕХАНИЗМЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК
УДК 591.3:591.481:597.5
НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КЛЕТОК ПЕРИВЕНТРИКУЛЯРНОЙ ЗОНЫ МОЗГА СИМЫ Oncorhynchus masou (SALMONIDAE)
© 2012 г. Е. В. Пущина1, Д. К. Обухов2, А. А. Вараксин1
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17 E-mail: puschina@mail.ru 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9 Поступила в редакцию 09.12.10 г.
Окончательный вариант получен 31.01.11 г.
Исследовали локализацию ГАМК, тирозингидроксилазы (ТН), NADPH-диафоразы, транскрипционного фактора Рахб и пролиферативного ядерного антигена (PCNA) в перивентрикулярной области мозга симы Oncorhynchus masou различных возрастных групп. В промежуточном мозге, центральном сером слое дорсомедиального тегментума, продолговатом и спинном отделах мозга симы показано наличие гетерогенных популяций клеток с радиально ориентированными отростками. ТН-, ГАМК-иммунопозитивные и NADPH-d-позитивные клетки расположены в областях PCNA-иммуногенных пролиферативных зон. Возможно, эти клетки являются потомками радиальной глии и участвуют в росте и физиологической регенерации диэнцефалических и медуллярных структур. В разных возрастных группах симы маркирование ТН-, ГАМК, PCNA и Pax6 выявляет нейро-мерную конструкцию мозга.
Ключевые слова: радиальная глия, костистые рыбы, постнатальный нейрогенез, нейротрансмиттер-ная сигнализация, миграция, тирозингидроксилаза, ГАМК, развитие, Рахб, МАЭРН-диафораза, пролиферация.
У разных видов рыб, включая нейрогенетиче-скую модель — данио Danio rerio, в головном мозге показано наличие пролиферативных перивентри-кулярных областей (Zupanc, Horschke, 1995). Результаты недавних исследований на Danio rerio (Grandel et al., 2006) показали, что, новообразованные клетки двигаются от желудочка вглубь мозга, где они дифференцируются в нейроны. Интерес к исследованию этих процессов у рыб обусловлен тем, что радиальная глия (РГ) в большом количестве присутствует в их мозге во взрослом состоянии, поскольку мозг рыб продолжает расти на протяжении всей жизни (Zupanc, 2006). Несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие РГ в процессе нейрогенеза взрослых животных мало изучено. Одной из причин недостатка такой информации является отсутствие надежных маркеров РГ у низших позвоночных. Иммуногистохи-мические маркеры астроцитарной глии млекопитающих, такие как глиальный фибриллярный кислый протеин (GFAB), виментин (V) или протеин S-100 маркирует лишь отдельные клетки РГ рыб, а окрашивание часто ограничивается либо телом клетки, либо ее длинным отростком (Pelligrini et al., 2007). Наши предварительные исследования на симе показали, что в отличие от других видов
рыб ТН в мозге симы маркирует специфический тип перивентрикулярно расположенных клеток, имеющих длинные радиальные отростки. Такие клетки расположены вдоль просвета III желудочка и в каудальных областях мозга (Пущина, 2010). Сходную картину мы наблюдали при иммуномар-кировании ГАМК (Р^ИеЫпа, ОЪикИоу, 2010). Другим нейрохимическим маркером перивентрику-лярной глии в мозге костистых рыб является МАЭРН-диафораза, впервые описанная в перивентрикулярной зоне мозга солнечника (Ма, 1993).
Используя способность популяции перивен-трикулярных клеток в мозге симы синтезировать ТН, ГАМК, МАЭРН-ё мы решили исследовать области локализации данных маркеров и оценить изменения в ходе постнатального морфогенеза. В качестве маркера нейродетерминации ^иШшапп, Ми11ег, 2004) и "нейрогенетических ниш" (очагов постнатального нейрогенеза млекопитающих, см. Maekawa е! а1., 2005, О8иш е! а1., 2008) у симы был использован транскрипционный фактор Рахб. Для идентификации пролиферирующих клеток мы использовали пролиферативный ядерный антиген (Пущина и др., 2007) .
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектами исследования послужили трех- и шестимесячные сеголетки (по 20 экз.), годовики (20 экз.) и половозрелые (20 экз.) особи симы On-corhynchus masou полученные c Рязановского экспериментально-производственного рыбоводного завода в 2009 г. Животных содержали в аквариумах с аэрируемой пресной водой при температуре 17— 18°С; анестезировали, помещая в кювету с 1% раствором MS-222 на морской воде на 10—15 мин.
Гистохимическое исследование активности NADPH-d проводили в соответствии с общепринятой методикой (Hope, Vincent, 1989), адаптированной нами для головного мозга рыб (Пущина, 2007). Контрольные препараты помещали в среду с добавлением ингибитора NO-синтазы 10 мМ ^монометил^-аргинина. Выявление ядерного антигена пролиферации (PCNA) проводили на парафиновых срезах мозга симы в соответствии с ранее описанной схемой (Пущина и др., 2007).
Иммуногистохимическое выявление ТН, ГАМК, и транскрипционного фактора Pax6 проводили с помощью стандартного авидин-биотино-вого пероксидазного маркирования на свободноплавающих срезах. Срезы инкубировали с мо-ноклональными антителами мыши против ГАМК (ICN, Biomedicals, USA), (1 : 5000), тиро-зингидроксилазы (Vector Laboratories, Burlin-game, USA), (1 : 10000), с моноклональными антителами человека против транскрипционного фактора Pax6 (Chemicon, USA) (1 : 4000), при температуре 4°С в течение 2 сут. Для визуализации им-муногистохимического маркирования использовали стандартный набор (Vectastain Elite АВС Kit, Burlingame, USA). Для выявления продуктов реакции использовали субстраты синего (ГАМК, Pax6) и красного (TH) цветов (VIP Substrate Kit, Vector Labs, Burlingame, USA). Процесс окрашивания контролировали под микроскопом, срезы промывали в воде, монтировали на предметные стекла, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам. Препараты просматривали и фотографировали на микроскопе Axiovert Apotome.
Оценку специфичности иммуногистохимиче-ской реакции проводили методом негативного контроля. Срезы мозга, вместо первичных антител, инкубировали с 1% неимунной сывороткой лошади в течение 1 сут и далее проводили как с первичными антителами. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция отсутствовала.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Верифкация ГАМК, ТН, NADPH-d и Pax6 в мозге симы выявила клетки, расположенные в пе-ривентрикулярной зоне (ПВЗ) различных областей мозга. Результаты исследований мозга раз-
личных возрастных групп симы показали, что ГАМК, ТН и Pax6 селективно маркирует перивен-трикулярные клетки и волокна в диэнцефалоне, тектуме, мозжечке, продолговатом мозге и спинном мозге. Паттерны распределения данных им-муномаркеров соответствуют нейромерной организации мозга симы. На границах первых трех прозомеров, включающих претектум (Р1), дорсальный таламус (Р2) и вентральный таламус (Р3), и ромбомеров продолговатого мозга иммуномар-кирование ГАМК, ТН и Pax6 отсутствовало.
В спинном мозге годовалой молоди симы ТН маркировала тела клеток, расположенных у центрального канала и радиально ориентированные волокна, которые на периферии спинного мозга формировали характерные "концевые ножки" (рис. 1, а—в). Иммуногистохимическое (ИГХ) маркирование транскрипционного фактора Pax6 и ТН показало наличие иммунореактивной глии в поверхностных слоях тектума у 3-х и 6 месячной молоди, а также в перивентрикулярном и центральном фиброзном слоях (рис. 1, г, д). Маркирование Pax6 у годовалой симы позволило идентифицировать Р1—Р3 прозомеры, включающие претектум (Р1), дорсальный таламус (Р2) и вентральный таламус (Р3) (рис. 1, е, ж). В мозжечке годовалой симы Рахб-ир клетки были выявлены в области ганглио-нарного слоя (рис. 1, з). Наибольшая плотность ГАМК-ир волокон и клеточных тел была выявлена в диэнцефалоне полугодовалой симы.
У взрослых особей симы ТН маркирует клетки с радиально ориентированными отростками в области zona limitans — границе отделяющей паллиаль-ную часть конечного мозга от субпаллиальной (рис. 2, а, б). В перивентрикулярных областях промежуточного мозга ТН маркирует клетки с ради-ально ориентированными отростками, расположенные вдоль всего инфундибулюма; в дорсальной области диэнцефалона — на территории претектума, дорсальных и вентро-медиальных ядер таламуса (рис. 2, в), передней части паравен-трикулярного органа (рис. 2, г). В вентральной области — в мелкоклеточной части преоптического ядра (рис. 2, д) и переднетуберального ядра. В промежуточном мозге маркирование ТН идентифицировало границы прозомеров (рис. 2, е). В продолговатом мозге симы ТН маркирует клетки с их длинными отростками вокруг медиального продольного пучка (рис. 2, ж) и вентромедиальном медуллярном сегменте (рис. 2, з). Наиболее крупное скопление ТН-ир клеток и радиально ориентированных волокон в продолговатом мозге симы выявлено в интерфасцикулярной области (рис. 2, ж). В каудальных областях ТН маркирует пери-вентрикулярные клетки с радиальными отростками в субвентрикулярной области на территории ядер IX-X черепно-мозговых нервов (рис. 2, ж). Иммунопозитивные клетки сходной морфологии были выявлены в медиальной и латеральной обла-
Рис. 1. Иммунолокализация ТН и транскрипционного фактора Pax6 в мозге разновозрастной молоди симы Oncorhynchus masou. а — иммунолокализация ТН в спинном мозге годовалой симы, стрелками показаны тела клеток, расположенных у просвета центрального канала, мелкими фигурными стрелками на б и в показаны радиальные волокна, квадратом ограничены участки волокон с "концевыми ножками", обозначенными черными стрелками на б, г — ТН в поверхностных слоях тектума трехмесячной симы, черными стрелками показаны тела глиальных клеток, мелкими фигурными стрелками показаны волокна, д — Pax6 в тектуме полугодовалой симы, сплошными стрелками показаны тела иммуногенных клеток перивентрикулярного слоя, стрелками с прорезью тела мигрировавших клеток, фигурными стрелками радиальные волокна; Pax6 в претектуме на е, таламусе на ж и в мозжечке на з годовалой симы, квадратами окунтурены скопления иммунопозитивных клеток, соответствующих претектальному (Пт), дорсальному (Дт) и вентральному (Вт) таламическо-му прозомерам; белыми стрелками показаны тела Рахб-ир клеток, черными стрелками
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.