научная статья по теме НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КЛЕТОК ПЕРИВЕНТРИКУЛЯРНОЙ ЗОНЫ МОЗГА СИМЫ ONCORHYNCHUS MASOU (SALMONIDAE) Биология

Текст научной статьи на тему «НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КЛЕТОК ПЕРИВЕНТРИКУЛЯРНОЙ ЗОНЫ МОЗГА СИМЫ ONCORHYNCHUS MASOU (SALMONIDAE)»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 1, с. 39-53

МЕХАНИЗМЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК

УДК 591.3:591.481:597.5

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КЛЕТОК ПЕРИВЕНТРИКУЛЯРНОЙ ЗОНЫ МОЗГА СИМЫ Oncorhynchus masou (SALMONIDAE)

© 2012 г. Е. В. Пущина1, Д. К. Обухов2, А. А. Вараксин1

Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17 E-mail: puschina@mail.ru 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9 Поступила в редакцию 09.12.10 г.

Окончательный вариант получен 31.01.11 г.

Исследовали локализацию ГАМК, тирозингидроксилазы (ТН), NADPH-диафоразы, транскрипционного фактора Рахб и пролиферативного ядерного антигена (PCNA) в перивентрикулярной области мозга симы Oncorhynchus masou различных возрастных групп. В промежуточном мозге, центральном сером слое дорсомедиального тегментума, продолговатом и спинном отделах мозга симы показано наличие гетерогенных популяций клеток с радиально ориентированными отростками. ТН-, ГАМК-иммунопозитивные и NADPH-d-позитивные клетки расположены в областях PCNA-иммуногенных пролиферативных зон. Возможно, эти клетки являются потомками радиальной глии и участвуют в росте и физиологической регенерации диэнцефалических и медуллярных структур. В разных возрастных группах симы маркирование ТН-, ГАМК, PCNA и Pax6 выявляет нейро-мерную конструкцию мозга.

Ключевые слова: радиальная глия, костистые рыбы, постнатальный нейрогенез, нейротрансмиттер-ная сигнализация, миграция, тирозингидроксилаза, ГАМК, развитие, Рахб, МАЭРН-диафораза, пролиферация.

У разных видов рыб, включая нейрогенетиче-скую модель — данио Danio rerio, в головном мозге показано наличие пролиферативных перивентри-кулярных областей (Zupanc, Horschke, 1995). Результаты недавних исследований на Danio rerio (Grandel et al., 2006) показали, что, новообразованные клетки двигаются от желудочка вглубь мозга, где они дифференцируются в нейроны. Интерес к исследованию этих процессов у рыб обусловлен тем, что радиальная глия (РГ) в большом количестве присутствует в их мозге во взрослом состоянии, поскольку мозг рыб продолжает расти на протяжении всей жизни (Zupanc, 2006). Несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие РГ в процессе нейрогенеза взрослых животных мало изучено. Одной из причин недостатка такой информации является отсутствие надежных маркеров РГ у низших позвоночных. Иммуногистохи-мические маркеры астроцитарной глии млекопитающих, такие как глиальный фибриллярный кислый протеин (GFAB), виментин (V) или протеин S-100 маркирует лишь отдельные клетки РГ рыб, а окрашивание часто ограничивается либо телом клетки, либо ее длинным отростком (Pelligrini et al., 2007). Наши предварительные исследования на симе показали, что в отличие от других видов

рыб ТН в мозге симы маркирует специфический тип перивентрикулярно расположенных клеток, имеющих длинные радиальные отростки. Такие клетки расположены вдоль просвета III желудочка и в каудальных областях мозга (Пущина, 2010). Сходную картину мы наблюдали при иммуномар-кировании ГАМК (Р^ИеЫпа, ОЪикИоу, 2010). Другим нейрохимическим маркером перивентрику-лярной глии в мозге костистых рыб является МАЭРН-диафораза, впервые описанная в перивентрикулярной зоне мозга солнечника (Ма, 1993).

Используя способность популяции перивен-трикулярных клеток в мозге симы синтезировать ТН, ГАМК, МАЭРН-ё мы решили исследовать области локализации данных маркеров и оценить изменения в ходе постнатального морфогенеза. В качестве маркера нейродетерминации ^иШшапп, Ми11ег, 2004) и "нейрогенетических ниш" (очагов постнатального нейрогенеза млекопитающих, см. Maekawa е! а1., 2005, О8иш е! а1., 2008) у симы был использован транскрипционный фактор Рахб. Для идентификации пролиферирующих клеток мы использовали пролиферативный ядерный антиген (Пущина и др., 2007) .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектами исследования послужили трех- и шестимесячные сеголетки (по 20 экз.), годовики (20 экз.) и половозрелые (20 экз.) особи симы On-corhynchus masou полученные c Рязановского экспериментально-производственного рыбоводного завода в 2009 г. Животных содержали в аквариумах с аэрируемой пресной водой при температуре 17— 18°С; анестезировали, помещая в кювету с 1% раствором MS-222 на морской воде на 10—15 мин.

Гистохимическое исследование активности NADPH-d проводили в соответствии с общепринятой методикой (Hope, Vincent, 1989), адаптированной нами для головного мозга рыб (Пущина, 2007). Контрольные препараты помещали в среду с добавлением ингибитора NO-синтазы 10 мМ ^монометил^-аргинина. Выявление ядерного антигена пролиферации (PCNA) проводили на парафиновых срезах мозга симы в соответствии с ранее описанной схемой (Пущина и др., 2007).

Иммуногистохимическое выявление ТН, ГАМК, и транскрипционного фактора Pax6 проводили с помощью стандартного авидин-биотино-вого пероксидазного маркирования на свободноплавающих срезах. Срезы инкубировали с мо-ноклональными антителами мыши против ГАМК (ICN, Biomedicals, USA), (1 : 5000), тиро-зингидроксилазы (Vector Laboratories, Burlin-game, USA), (1 : 10000), с моноклональными антителами человека против транскрипционного фактора Pax6 (Chemicon, USA) (1 : 4000), при температуре 4°С в течение 2 сут. Для визуализации им-муногистохимического маркирования использовали стандартный набор (Vectastain Elite АВС Kit, Burlingame, USA). Для выявления продуктов реакции использовали субстраты синего (ГАМК, Pax6) и красного (TH) цветов (VIP Substrate Kit, Vector Labs, Burlingame, USA). Процесс окрашивания контролировали под микроскопом, срезы промывали в воде, монтировали на предметные стекла, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам. Препараты просматривали и фотографировали на микроскопе Axiovert Apotome.

Оценку специфичности иммуногистохимиче-ской реакции проводили методом негативного контроля. Срезы мозга, вместо первичных антител, инкубировали с 1% неимунной сывороткой лошади в течение 1 сут и далее проводили как с первичными антителами. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция отсутствовала.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Верифкация ГАМК, ТН, NADPH-d и Pax6 в мозге симы выявила клетки, расположенные в пе-ривентрикулярной зоне (ПВЗ) различных областей мозга. Результаты исследований мозга раз-

личных возрастных групп симы показали, что ГАМК, ТН и Pax6 селективно маркирует перивен-трикулярные клетки и волокна в диэнцефалоне, тектуме, мозжечке, продолговатом мозге и спинном мозге. Паттерны распределения данных им-муномаркеров соответствуют нейромерной организации мозга симы. На границах первых трех прозомеров, включающих претектум (Р1), дорсальный таламус (Р2) и вентральный таламус (Р3), и ромбомеров продолговатого мозга иммуномар-кирование ГАМК, ТН и Pax6 отсутствовало.

В спинном мозге годовалой молоди симы ТН маркировала тела клеток, расположенных у центрального канала и радиально ориентированные волокна, которые на периферии спинного мозга формировали характерные "концевые ножки" (рис. 1, а—в). Иммуногистохимическое (ИГХ) маркирование транскрипционного фактора Pax6 и ТН показало наличие иммунореактивной глии в поверхностных слоях тектума у 3-х и 6 месячной молоди, а также в перивентрикулярном и центральном фиброзном слоях (рис. 1, г, д). Маркирование Pax6 у годовалой симы позволило идентифицировать Р1—Р3 прозомеры, включающие претектум (Р1), дорсальный таламус (Р2) и вентральный таламус (Р3) (рис. 1, е, ж). В мозжечке годовалой симы Рахб-ир клетки были выявлены в области ганглио-нарного слоя (рис. 1, з). Наибольшая плотность ГАМК-ир волокон и клеточных тел была выявлена в диэнцефалоне полугодовалой симы.

У взрослых особей симы ТН маркирует клетки с радиально ориентированными отростками в области zona limitans — границе отделяющей паллиаль-ную часть конечного мозга от субпаллиальной (рис. 2, а, б). В перивентрикулярных областях промежуточного мозга ТН маркирует клетки с ради-ально ориентированными отростками, расположенные вдоль всего инфундибулюма; в дорсальной области диэнцефалона — на территории претектума, дорсальных и вентро-медиальных ядер таламуса (рис. 2, в), передней части паравен-трикулярного органа (рис. 2, г). В вентральной области — в мелкоклеточной части преоптического ядра (рис. 2, д) и переднетуберального ядра. В промежуточном мозге маркирование ТН идентифицировало границы прозомеров (рис. 2, е). В продолговатом мозге симы ТН маркирует клетки с их длинными отростками вокруг медиального продольного пучка (рис. 2, ж) и вентромедиальном медуллярном сегменте (рис. 2, з). Наиболее крупное скопление ТН-ир клеток и радиально ориентированных волокон в продолговатом мозге симы выявлено в интерфасцикулярной области (рис. 2, ж). В каудальных областях ТН маркирует пери-вентрикулярные клетки с радиальными отростками в субвентрикулярной области на территории ядер IX-X черепно-мозговых нервов (рис. 2, ж). Иммунопозитивные клетки сходной морфологии были выявлены в медиальной и латеральной обла-

Рис. 1. Иммунолокализация ТН и транскрипционного фактора Pax6 в мозге разновозрастной молоди симы Oncorhynchus masou. а — иммунолокализация ТН в спинном мозге годовалой симы, стрелками показаны тела клеток, расположенных у просвета центрального канала, мелкими фигурными стрелками на б и в показаны радиальные волокна, квадратом ограничены участки волокон с "концевыми ножками", обозначенными черными стрелками на б, г — ТН в поверхностных слоях тектума трехмесячной симы, черными стрелками показаны тела глиальных клеток, мелкими фигурными стрелками показаны волокна, д — Pax6 в тектуме полугодовалой симы, сплошными стрелками показаны тела иммуногенных клеток перивентрикулярного слоя, стрелками с прорезью тела мигрировавших клеток, фигурными стрелками радиальные волокна; Pax6 в претектуме на е, таламусе на ж и в мозжечке на з годовалой симы, квадратами окунтурены скопления иммунопозитивных клеток, соответствующих претектальному (Пт), дорсальному (Дт) и вентральному (Вт) таламическо-му прозомерам; белыми стрелками показаны тела Рахб-ир клеток, черными стрелками

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком