НЕИРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 1, с. 84-90
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 612.8
НЕЙРОИММУННЫЕ АСПЕКТЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ МОЗГА ПОСЛЕ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ
© 2014 г. М. В. Онуфриев*, М. Ю. Степаничев, ^ О. Тишкина, С. В. Сидорова, Н. В. Гуляева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
Исследовано содержание продуктов нитрозативного стресса, иммуноглобулинов и аутоантител к нитрованным белкам в спинномозговой жидкости (СМЖ) и в коре больших полушарий крыс через 24 ч после фокальной ишемии. В остром периоде после ишемии уровень метаболитов оксида азота, нитратов и нитритов, достоверно увеличивался как в СМЖ, так и в коре ишемического полушария животных. Кроме того, в СМЖ крыс достоверно возростало содержание иммуноглобулинов (1§) и усиливалось связывание нитротирозин-БСА. Иммунохимическое окрашивание срезов мозга антителами к крысы выявило их присутствие в области ишемического очага, но не в контралатеральном полушарии. В ишеми-ческом полушарии в некоторых ^-позитивных клетках наблюдалась колокализация окрашивания с проапоптотическим белком Вах. В этот приод в пораженном полушарии иммуногистохимически детектировали также появление мембраноатакующего комплекса — продукта терминальной стадии активации комплемента. Таким образом, развитие иммунного ответа в остром периоде после экспериментального инсульта отчасти связано с признаками апоптотической гибели клеток и, по-видимому, в определенной степени модулируется такими продуктами нитрозативного стресса, как модифицированные нитрованием белки.
Ключевые слова: оксид азота, нитротирозин, аутоантитела, нитрозативный стресс, комплемент, инсульт.
БОТ: 10.7868/81027813314010129
Известно, что при ишемии/реперфузии мозга происходит активация различных изоформ МО-синтаз, что приводит к избыточной продукции N0 и образованию сильного окислителя пе-роксинитрита, который участвует в нитровании остатков тирозина в белках [1]. Так, на ранних стадиях ишемии/реперфузии нейрональная N0-синтаза (нМОС) играет доминирующую роль в образовании нитротирозина в мозге, а на поздних стадиях образование пероксинитрита обеспечивается экспрессией индуцибельной МОС (иМОС) [2, 3]. Эти события принято считать основными признаками нитрозативного стресса.
С другой стороны, в ответ на ишемический инсульт усиливается реакция иммунной системы и происходит образование антител против антигенов ЦНС, таких как основной белок миелина, нейрон-специфичная енолаза, белок 8100р, ММЭЛ-рецеп-торы, нейрофиламенты [4]. Более того, присутствие нитрованных белков и пептидов также способствует усилению продукции иммуноглобулинов, специфически распознающих нитротирозин [5]. Образование иммунного комплекса антиген-антитело инициирует один из 3-х путей активации каскада комплемента, который является важной частью
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: mikeonuf1@rambler.ru.
врожденного иммунитета, а его активация вследствие церебральной ишемии опосредует нейровос-паление и гибель клеток [6].
В предыдущем исследовании мы показали, что в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных в остром периоде после различных типов инсульта возростали показатели нитрозативного стресса и иммунного ответа [7]. В связи с этим, целью настоящей работы явилось дальнейшее исследование нейроиммунных взаимодействий и их вклада в повреждение и гибель клеток мозга на модели экспериментального инсульта.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фокальную ишемию мозга создавали с использованием интралюминального введения фи-ламента по методу, описанному Zea Longa и соавт. [8]. В работе использовали 15 самцов крыс линии Wistar массой 200—250 г. Через 24 ч после 20-минутной окклюзии левой среднемозговой артерии (ОСМА) животных наркотизировали, собирали СМЖ из мозжечково-мозговой цистерны (cisterna magna) при помощи иглы, центрифугировали для удаления клеток, аликвотировали и хранили до анализа при температуре —80°С. Ложноопери-рованных животных подвергали всем этапам операции, кроме введения филамента.
ч30
s
л
^320
я
10
0
** т
- ЯР
-
1 1
40
св
м
(U ■ VO
<20 л
ч о
g 10 Я
Контроль
Ишемия
Контроль
Ишемия
Рис. 1. Содержание N0^ в коре больших полушарий (а) и СМЖ крыс (б) через 24 ч после фокальной ишемии мозга. *р < 0.05; **р < 0.01 — отличия от контроля.
1500000
«
и
« 1000000 а
о
е
мин 500000
£2
л о
м0
е
X
* *
Контроль
Ишемия
>, 150000 «
а
Я 100000 а
о
е н
ми 50000
л о
м0 е
X
Контроль
Ишемия
Рис. 2. Содержание (а) и связывание нитротирозин-БСА (б) в СМЖ через 24 ч после ОСМА. **р < 0.01; отличия от контроля.
0
* *
Суммарную концентрацию стабильных метаболитов оксида азота — нитратов и нитритов (NOx) в СМЖ и супернатантах коры больших полушарий крыс определяли флюориметрическим методом с использованием 2,3-диаминонафталина [9]. Содержание иммуноглобулинов (Ig) определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием поликлональных антител к крысиным иммуноглобулинам IgG, IgM и IgA классов ("Имтек", Россия). Связывание нитро-тирозин-БСА ("Саутап", США) с белками ликвора оценивали методом ИФА с использованием поликлональных антител к нитротирозину ("Саутап", США).
Для гистологического исследования крыс наркотизировали интраперитонеальной инъекцией хлоралгидрата (400 мг/кг) и мозг фиксировали транскардиальной перфузией 10% нейтральным формалином через 4, 10 и 24 ч после ОСМА. После дофиксации в течение 48 ч готовили фронтальные 50 мкм срезы с помощью вибрационного микротома Leica VT 1200S (Leica, Германия). Срезы мозга крыс окрашивали гематоксилином-эозин-флок-сином. Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием антител к Ig крысы ("Имтек", Россия), проапоптотическому белку Bax ("Santa Cruz", США) и мембраноатакующему комплексу (МАК) С5Ь-9 ("Santa Cruz", США).
Данные представлены в виде M ± SEM. Достоверность различий между группами оценивали при помощи i-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выход метаболитов NO в СМЖ крыс через 24 ч реперфузии достоверно увеличился в 1.5 раза по сравнению с ложнооперированными животными (рис. 1а). Повышенное содержание NОx также было зафиксировано в коре левого ишемического полушария и достоверно превышало таковое в контралатеральном полушарии в 1.26 раза (рис. 15). Повышение содержания метаболитов NO в коре ишемического полушария и СМЖ крыс согласуется с данными, полученными на моделях экспериментального инсульта другими исследователями. Так, через 24 ч после 2 ч ОСМА у крыс увеличение содержания NOx выявлено в коре ипсилатерального полушария крыс, а также в плазме крови и СМЖ, что по мнению авторов является отражением повышенной генерации NO в мозге крыс из-за активности иNOC [10].
В СМЖ крыс после ОСМА выявлено 2-х-крат-ное повышение содержания Ig через 24 ч репер-фузии (рис. 2а). Связывание СМЖ нитротиро-зин-БСА исходно наблюдалось в группе ложно-оперированных животных, но достоверно увеличилось в 1.53 раза в ликворе после ОСМА
У
Рис. 3. Патологические изменения ткани мозга через 24 ч после ОСМА и иммуногистохимическая детекция крысы в области инфаркта. а — срезы мозга крысы, окрашенные гематоксилином и эозин-флоксином. Очерчены области инфаркта. б — параллельные срезы мозга крыс, окрашенные антителами к крысы.
Рис. 4. Локализация иммуногистохимического окрашивания на ^ в области инфаркта в коре больших полушарий (а, б) и стриатуме (в, г) через 24 ч после ОСМА. Стрелками указаны ^-позитивные нейроноподобные клетки.
ЕЙ шт*
<Р
ш
27 •>
/ -Vх • ш
_ Щ. • ^
-Ч ■ #
200 мкм , _| б
■ ■
Я.
50 мкм
I_I
■шшт:. ^ ■
(рис. 2б). Выявлена прямая корреляция (коэфици-ент корреляции Пирсона) между содержанием ^ в СМЖ и связыванием нитротирозин-БСА (г = 0.80, р < 0.05).
Оценку развития патологических изменений в мозге крыс проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозин-флоксином (рис. 3а). ОСМА приводила к развитию относительно большого очага инфаркта в ипсилатеральном полушарии через 24 ч реперфузии. Очаг повреждения частично затрагивал фронтальную, фронто-париетальную моторную и соматосенсорную области новой коры. Наряду с новой корой очаг инфаркта располагался также в ядрах полосатого тела (стриатума). В очаге инфаркта наблюдалась выраженная гибель нейронов, большинство из которых имели типичные ишемические изменения, такие как треугольная форма, пикнотичное ядро с гиперхромной окраской, эозинофильная цитоплазма. В периинфарктной зоне ишемические повреждения были менее выражены, что, по-видимому, связано с временными характеристиками развития патологического процесса. В
контралатеральном полушарии перечисленные клеточные изменения полностью отсутствовали.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга антителами к ^ крысы выявило их присутствие в ткани мозга через 24 ч после ОСМА (рис. 3б). Окраска была локализована в области ишемического очага и профили иммунохимиче-ского окрашивания практически полностью совпадали с областью повреждения, выявляемой на соседних срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, на всем протяжении инфаркта как в ла-терально-медиальном, так и в ростро-каудальном направлении. Следует отметить, что иммунореак-тивность наблюдалась как в нейропиле, так и в отдельных клетках (рис. 4). Окрашенные профили клеток располагались в области пирамидных слоев неокортекса и стриатума и по очертаниям (форма тела и наличие апикального дендрита) были похожи на нейроны. Иммунореактивность к ^ крысы полностью отсутствовала в контрала-теральном полушарии. В единственном исследовании, посвященном этой проблеме, зарегистрировано появление IgG в мозге крыс через 24 ч после ОСМА [11]. Авторы интерпретируют это как
DAPI . Bax
•
Ф _ 1
а щ 10 мкм 1 1 I*
YZ
0
-10
-20
305! м
40 ^ 50 1-60
10 мкм
XY
0 10-1
20 км30
- 40-
50
60 Ч
i i i i
16 8 0
~1 I I I I I I Г
0 10 20 30 40 50 60 70 80 x, мкм
Рис. 5. Экспрессия Вах в ^-позитивных нейронах области ишемического повреждения мозга через 24 ч после ОСМА (а—г). Тонкими белыми стрелками обозначены клетки, в которых наблюдается дво
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.