научная статья по теме НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ ПЕПТИДОВ-АНАЛОГОВ ПРИВЯЗАННОГО ЛИГАНДА, ОСВОБОЖДАЕМОГО АКТИВИРОВАННЫМ ПРОТЕИНОМ С Биология

Текст научной статьи на тему «НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ ПЕПТИДОВ-АНАЛОГОВ ПРИВЯЗАННОГО ЛИГАНДА, ОСВОБОЖДАЕМОГО АКТИВИРОВАННЫМ ПРОТЕИНОМ С»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 468-473

УДК 576

НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ ПЕПТИДОВ-АНАЛОГОВ ПРИВЯЗАННОГО ЛИГАНДА, ОСВОБОЖДАЕМОГО АКТИВИРОВАННЫМ ПРОТЕИНОМ С

© 2013 г. И. Г. Савинкова1*, Л. Р. Горбачева1, 4, Ж. Д. Беспалова3, В. Г. Пинелис2, С. М. Струкова1

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12; *электронная почта: irenesavik@mail.ru 2Научный центр здоровья детей РАМН, 119991, Москва, Ломоносовский просп., 2, стр.1 3Институт экспериментальной кардиологии, КНЦМЗ РФ, 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а 4Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ,

117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Поступила в редакцию 06.05.2013 г.

Протеиназы гемостаза могут появляться в ткани мозга при травме и воспалении в результате нарушения целостности гематоэнцефалического барьера. Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные рецепторы, активируемые протеиназами (PARs), сопряженные с G-белками. Протеиназы расщепляют одну пептидную связь экзодомена рецептора, что приводит к образованию нового N-конца ("привязанного лиганда"), который обладает способностью специфически взаимодействовать со второй внеклеточной петлей молекулы рецептора и активировать его. Для цитопротекторного действия активированного протеина С (АРС) на эндотелиальных клетках и нейронах необходимы два типа рецепторов — EPCR и PAR1. АРС, активируя PAR-1, контролирует экспрессию генов провоспалительных и про-апоптотических факторов, оказывает протекторное действие на нейроны в условиях стресса и на эндотелий мозга при гипоксиии, а также стабилизирует эндотелиальный барьер. Мы предположили, что пептиды-аналоги "привязанного лиганда" PAR1, освобождаемого АРС, могут оказывать нейропротекторное действие, подобное действию АРС. Для моделирования ишемического повреждения мозга мы использовали модель глу-таматной эксайтотоксичности на первичной культуре гиппокампальных нейронов новорожденных крысят. Исследованные пептиды NPNDKYEPF-амид (пептид-9) и NPNDKYEPFWE (пептид-11) более эффективно снижали уровень апоптоза в нейронах при эксайтотоксичности, чем АРС, при этом влияние на количество живых и некротических клеток при действии пептидов было аналогично эффектам АРС. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что протекторное действие этих пептидов-аналогов "привязанного лиганда" PAR1 сопоставимо с защитным действием АРС при глутаматной эксайтотоксичности. Исследование механизмов действия пептидов-агонистов PAR1, а также разработка их модифицированных укороченных версий с высокой нейропротекторной активностью может быть актуальным направлением в поиске новых нейропротекторных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и инсультов.

Ключевые слова: активированный протеин С, нейропротекция, PAR, нейроны.

DOI: 10.7868/S0233475513050174

Исследование механизмов нейродегенерации при ишемическом инсульте и травмах мозга, а также поиск новых протекторных агентов, защищающих нейроны от гибели, является одной из ключевых задач современной физиологии.

Механизм активации рецепторов, активируемым протеиназами (PAR), был обнаружен и детально изучен для PAR-1 [1] и других рецепторов семейства PAR [2]. Протеиназы расщепляют одну

пептидную связь экзодомена рецептора, что приводит к образованию нового N-конца ("привязанного лиганда"), который обладает способностью специфически взаимодействовать со второй внеклеточной петлей молекулы рецептора и активирует его [2]. Тромбин расщепляет пептидную связь между остатками Аг§41и Ser42 в PAR1. Расщепление тромбином PAR1 необратимо и приводит к образованию нового N-конца, который работает по принципу "привязанного лиганда"

1.5 г

Рис. 1. Влияние глутамата (100 мкМ), активированного протеина С (APC, 1 нМ), 9-членного и 11-членного пептидов-аналогов "привязанного лиганда" PAR1 (20 мкМ), на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов. Различия достоверны приp < 0.05: * — по сравнению с контролем, # — по сравнению с глутаматом.

(S42FLLRN). Основный остаток аргинина "привязанного лиганда" связывается с отрицательно заряженным остатком глутамина второй внеклеточной петли PAR1, инициируя внутриклеточную сигнализацию [3].

Показано, что сериновые протеиназы гемостаза — тромбин и активированный протеин С (АРС), взаимодействуя с одним и тем же рецептором PAR-1, оказывают разнонаправленное действие при эксайтотоксичности и воспалении [4, 5]. Тромбин, наряду с прокоагулянтным действием, повышает экспрессию провоспалитель-ных и про-апоптотических факторов [4]. АРС, активируя PAR-1, контролирует экспрессию генов провоспалительных и про-апоптотических факторов, стабилизирует клетки эндотелия, нейроны и защищает их от гибели [4—6]. АРС — нейропро-тектор в стрессированных нейронах и в гипокси-ческом эндотелии мозга [5, 6]. Ранее в нашей лаборатории с помощью блокирующих анти-PARl антител и антагонистов PAR1 рецептора было доказано участие PAR1 в реализации нейропротек-торных эффектов АРС [7].

Недавно обнаружено, что разнонаправленное действие тромбина и АРС может быть обусловлено смещенным агонизмом (biased agonism) при действии протеиназ тромбина и АРС на PAR-1 клеток эндотелия [8—10]. При смещенном аго-низме вместо канонического расщепления тромбином по Arg41 в экзодомене PAR1 идентифици-

ровано APC-специфичное неканоническое расщепление по Arg46 в экзодомене PAR1 [10]. Новый привязанный лиганд — пептид Тр-47, на культивируемых клетках эндотелия имитировал вызванную АРС сигнализацию, но не сигнализацию, индуцируемую тромбином [10].

Мы предположили, что пептиды—аналоги привязанного лиганда PAR1, освобождаемого АРС могут проявлять также нейропротекторное действие, подобное действию АРС.

Для моделирования ишемического повреждения мозга мы использовали модель глутаматной эксайтотоксичности. При ишемии мозга происходит освобождение глутамата в межклеточное пространство, приводящее к активации пре- и постсинаптических глутаматных рецепторов. Последующее увеличение внутриклеточного [Ca2+] может приводить к дисфункции митохондрий, генерации активных форм кислорода и активации протеиназ, фосфорилаз и эндонуклеаз [11]. Массивный вход Са2+ в нервные клетки по каналам ионотропных глутаматных рецепторов нарушает гомеостаз этого внутриклеточного посредника, запускает каскад внутриклеточных реакций, которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток механизмами апоптоза или некроза [12, 13].

Целью нашей работы было изучение влияния пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого АРС, в сравнении с АРС, на выжива-

Фазовый контраст Syto 13 Hoechst 33342

Рис. 2. Типичные фотографии гиппокампальных нейронов через 24 ч после инкубации культур в присутствии глута-мата (Глу, 100 мкМ) (а), АРС и глутамата (б), 11-членного пептида (20 мкМ) и глутамата (пептид 11 + Глу) (в) и 9-член-ного пептида (20 мкМ) и глутамата (пептид 9 + Глу) (г). Количество живых и апоптотических нейронов определяли по флуоресценции красителей Syto-13 и Hoechst 33342 соответственно.

емость культивируемых гиппокампальных нейронов крыс через 24 ч после токсического воздействия глутамата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10-дневных), извлеченного из мозга 1-3-дневных крысят линии Вистар. Для моделирования глутаматной токсичности в культуре нейронов нейробазальную среду (NBM) заменяли на HEPES-солевой буфер (HBSS) и далее клетки инкубировали 40 мин в присутствии 100 мкМ глутамата. Состав HBSS в мМ: NaCl - 145, KCl - 5, CaCl2 - 1.8, MgCl2 - 1.0 (без

MgCl2 в случае экспозиции клеток с глутаматом); Gly - 0.01; HEPES - 20, глюкоза - 5 (рН 7.4). Для оценки влияния АРС на выживаемость нейронов при токсическом действии глутамата в среду за 15 мин до добавления глутамата добавляли АРС (1 нМ) или пептиды-аналоги "привязанного лиганда", освобождаемого АРС, (20 мкМ). Синтез пептида-9 (NPNDKYEPF-амид) и пептида-11 (NPNDKYEPFWE) был осуществлен в лаборатории синтеза пептидов ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Минздрава РФ по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе с применением методологии Fmoc-(9-флуоренил-метоксикарбонил). Структура пептидов подтвер-

Рис. 3. Влияние глутамата (100 мкМ), активированного протеина С (АРС, 1 нМ), 9-членного (20 мкМ ) и 11-членного пептидов-аналогов "привязанного лиганда" PAR1 (20 мкМ ) на апоптоз (а) и некроз (б) культивируемых гиппокам-пальных нейронов. Долю апоптозных клеток оценивали по количеству клеток, окрашенных Hoechst 33342, а долю клеток, подверженных некрозу — по количеству клеток, окрашенных бромистым этидиумом (EthD). Количество апо-птотических и некротических клеток в контроле принято за единицу. Различие статистически достоверно прир < 0.05: * — по сравнению с контролем, # — по сравнению с глутаматом.

ждена данными 1Н-ЯМР-спектроскопии, а их гомогенность — данными аналитической ВЭЖХ.

Морфологическая оценка гибели нейронов включала исследование живых клеток с использованием витального красителя Syto-13 (возбуждение 488 нм, эмиссия 520 нм; Sigma, США) [14], ядерной фрагментации (апоптоза) с помощью флуоресцентного ДНК-тропного красителя Hoechst 33342 (возбуждение 360 нм, эмиссия 460 нм; Sigma, США) и мертвых клеток с помощью бромистого этидиума (EthD), возбуждение 550 нм, эмиссия 620 нм, Sigma, США), который окрашивает только мертвые клетки, где нарушена плазматическая мембрана.

Флуоресцентные зонды были использованы в следующих концентрациях: Hoechst 33342 — 10 мкг/мл; Syto-13 - 1 мкМ; EthD - 3 мкМ. Окрашивание проводили добавлением маточных растворов к клеткам в буфер HBSS и инкубировали в течение 25-30 мин при 37°С в инкубаторе. Затем культуры ополаскивали буфером и помещали на столик флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 Zeiss, Германия) для подсчета клеток.

Обработку данных проводили с использованием i-теста. Для анализа использовали данные 46 независимых экспериментов. Различия считали достоверными пр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»