НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 90-98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8.015: 576.345
НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МИКРО- И НАНОМОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГАНГЛИОЗИДА GM1 НА КЛЕТКИ РС12 В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
© 2008 г. Н. Ф. Аврова*, Т. В. Соколова, И. О. Захарова, В. В. Фураев,
М. П. Рычкова, Ю. А. Власова
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург
Изучена зависимость иейропротекториого эффекта гаиглиозида GM1 от его концентрации на клетки нейрональной линии РС12 при цитотоксическом действии на них перекиси водорода. В диапазоне 1-50 мкМ и 1-10 нМ эффект GM1 тем выше, чем выше его концентрация. Но достоверных различий в эффектах 10 нМ, 100 нМ и 1 мкМ GM1 не выявлено, что, по-видимому, связано с переходом GM1 из мономерной в мицеллярную форму. Ганглиозид GM1 снижает образование активных форм кислорода и накопление малонового диальдегида, вызванные действием перекиси водорода, предохраняет от окислительной инактивации №+,К+-АТФазу клеток РС12. Показано, что действие GM1 зависит от модуляции им систем трансдукции сигнала. Так ингибиторы тирозинкиназы Trk-рецеп-торов и тирозинкиназ способны предотвращать или снижать эффекты GM1. При действии на клетки РС12 микромолярные концентрации GM1 более эффективны, чем наномолярные, а при действии на нервные окончания мозга, не имеющие ядер, напротив, наиболее действенными являются наномолярные концентрации. По-видимому, при действии этих низких концентраций GM1, в отличие от действия его микромолярных концентраций, не затрагиваются процессы, протекающие в ядрах клеток.
Ключевые слова: клетки РС12, окислительный стресс, ганглиозид GM1, нейропротекторный эффект, микро- и наномолярные концентрации, активные формы кислорода, Иа+,К+-АТФаза, ти-розинкиназа Trk-рецепторов.
ВВЕДЕНИЕ
Ганглиозиды представляют собой гликосфин-голипиды, содержащие сиаловые кислоты, характерные для нервной ткани, прежде всего для возбудимых мембран нервных клеток. Они принадлежат к числу биологически активных сфин-голипидов. Ганглиозиды способны модулировать метаболические процессы, в частности активность различных протеинкиназ и обладают ней-ропротекторным эффектом [1-3]. В природе существует большое число ганглиозидов, различающихся по своему строению и свойствам. Но четыре основных ганглиозида мозга млекопитающих (вМ1, вБ1а, ОБ1Ъ и СТЧЬ) имеют много общего как в структуре, так и функциях. Самым стабильным и чаще всего использующимся в исследованиях из этих ганглиозидов является вМ1. Показано, что эти ганглиозиды повышают жизнеспособность нейронов и клеток нейрональных линий в культуре, подвергнутых действию глута-мата и других нейротоксинов [4-6]. Введение вМ1 и других ганглиозидов животным с травмой или ишемией мозга уменьшает тяжесть поражения
* Адресат для корреспонденции: Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 37, тел.: (812) 552-80-35, факс: (812) 552-30-12, e-mail: avrova@iephb.ru
мозга, предотвращает или уменьшает метаболические нарушения, улучшает неврологические показатели и поведенческие реакции животных [2, 7]. Недавно [8-11] проведены широкомасштабные клинические испытания ганглиозида вМ1 (препарата 8у§еи), который, возможно, найдет свое применение в качестве лекарства при лечении травм спинного мозга [8, 10]. Но клинические испытания его введения пациентам с инсультом мозга, как и многих других соединений, обладающих защитным эффектом в опытах на животных, не дали благоприятного эффекта [9, 11]. Имеются также свидетельства улучшения состояния пациентов с болезнью Паркинсона и Альцгеймера при долгосрочном (не менее года) введении им ганглиозида вМ1 в ходе клинических испытаний этого препарата [12-14].
Но при этом большинство исследователей сходится во мнении, что механизм защитного действия ганглиозидов еще далек от понимания, что тормозит возможности их применения в качестве лекарственных веществ. В частности, по нашему мнению, важно выяснить какой эффект оказывают ганглиозиды в наномолярных концентрациях, которые можно рассматривать как физиологические, так как они характерны для спинномозговой
жидкости человека [15, 16]. Между тем в исследованиях на клетках мозга, как правило, применяются значительно более высокие концентрации вМ1 и других ганглиозидов, составляющие десятки микромолей [4, 17]. При действии этих высоких концентраций ганглиозидов возможно появление побочных эффектов [18-20], к тому же они намного превышают те концентрации ганглиозидов, которые способны оказывать защитный эффект на нервные клетки мозга при введении этих глико-липидов в организм животных или человека.
Целью настоящей работы является изучение влияния микро- и наномолярных концентраций ганглиозида вМ1 на жизнеспособность клеток РС12 и метаболические процессы в них в условиях окислительного стресса, вызванного Н202. При этих концентрациях ганглиозиды находятся как в форме мономеров, так и мицелл, что может обусловить различия в их эффектах. Такого рода данные представляют интерес для понимания механизма действия ганглиозидов на клетки мозга при их введении животным или людям в ходе клинических испытаний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В опытах использовали перекись водорода, АТФ, НАДН, ЭГТА, фосфоэнолпиру-ват, пируваткиназу, лактатдегидрогеназу, роте-нон, дихлородигидрофлуоресцеин-диацетат фирмы Sigma (США), пенициллин и стрептомицин фирмы Serva (Германия). Остальные химические препараты были отечественного производства -"х.ч." или "ч.д.а." Среда инкубации - DMEM с L-глутамином, сыворотка крови плодов коровы и лошади были куплены у фирмы Биолот (Россия).
Условия культивирования клеток. Опыты проводили на культуре нейрональной клеточной линии РС12 в инкубаторе при 5% СО2. Клетки РС12 были любезно предоставлены нам проф. Мюллером из университета г. Франкфурта (Германия). Клетки выращивали в питательной среде инкубации DMEM с L-глутамином, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы и 5% сыворотки крови лошади, 25 мкг/мл пенициллина и 25 ед/мл стрептомицина. Среду меняли каждые 2-3 дня. В опытах применяли среду DMEM с глу-тамином, не содержащую сыворотки. Клетки РС12 переносили из 75 см3 культуральных флас-ков, в которых их выращивали, в планшеты или небольшие чашки Петри. Количество клеток в одной лунке 24-луночных планшетов составляло 2-3 х 105, а в одной лунке 6-луночных планшетов -7 х 105 клеток. Количество клеток в 1 чашке Петри (диаметр 6 см), использовавшихся для определения активности Ка+,К+-АТФазы, составляло 1.5 х 106.
Эксперименты начинали через 24 ч или 48 ч после посева клеток в планшеты или чашки Петри. К клеткам добавляли свежую среду DMEM с L-глутамином, после чего инкубировали при 37°С в течение 0.5 ч с ингибиторами (или без них) и затем в течение 1 ч с GM1 (или без него). Затем добавляли H2O2 до конечной концентрации 1 мМ, обладающую цитотоксическим эффектом. Си-наптосомы выделяли из коры мозга крыс по методу Хайоша [21], как это было описано ранее [22].
Определение жизнеспособности клеток.
Жизнеспособность клеток оценивали по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), вышедшей из клеток в среду после воздействия H2O2. Чтобы исключить попадание отдельных неприкрепленных клеток в надосадочную жидкость, пробы центрифугировали в течение 5 мин при 300-400 g. Полный лизис клеток проводили, инкубируя их 30 мин с 1% Тритоном Х-100 при комнатной температуре, затем определяли общую активность фермента в пробах.
Об активности ЛДГ судили по изменению уровня NADH, который измеряли по уменьшению оптической плотности при 340 nm на спектрофотометре Specord М40 (Carl Zeiss, Германия) в течение 5-6 мин, как это описано в работе [23]. Реакцию проводили в среде следующего состава: 80 мМ трис-НС1, рН 7.2, 200 мМ NaCl, 1.6 мМ пи-руват, 0.2 мМ NADH. Процент активности ЛДГ, вышедшей из клеток в результате того или иного воздействия, определяли как процент активности фермента в культуральной среде к суммарной активности ЛДГ в пробах (в клетках и в среде). Ноль процентов жизнеспособности клеток соответствует 100 % активности ЛДГ в среде.
Определения содержания активных форм кислорода (АФК). Для определения их содержания клетки РС12 сеяли в 6-лун очный планшет. Эксперимент проводили в DMEM с L-глутами-ном, не содержащей сыворотки. Преинкубацию с ингибитором К-252а и затем с ганглиозидом GM1 проводили как указано ранее. После этого добавляли 1 мМ H2O2 и клетки с ней инкубировали в течение 1 ч. Флуоресцентный краситель дихлороди-гидрофлуоресцеин-диацетат вносили в среду за 20 мин до окончания инкубации с H2O2 в конечной концентрации 10 мкМ. Для отмывки от избытка красителя клетки переносили в конические пробирки и осаждали центрифугированием, затем промывали раствором Хэнкса. Для измерения флуоресценции продукта реакции АФК с дихлор-одигидрофлуоресцеин-диацетатом прописывали спектр эмиссии в диапазоне от 500 до 560 нМ при длине волны возбуждения 475 нМ на спектрофлу-ориметре "Shimadzu", пик эмиссии при X = 522 нМ. Содержание АФК в пробах выражали в условных единицах, отражающих интенсивность флуорес-
Таблица 1. Влияние разных концентраций ганглиози-да GM1 на цитотоксичность перекиси водорода при действии на клетки РС12 (% ингибирования цитоток-сического действия Н202)
Проба Число опытов % ингибирования действия Н202
1 нМ GM1 4 3.2 ± 1.7г
5 нМ GM1 3 13.0 ± 3.3в-г
10 нМ GM1 9 38.4 ± 11ад
100 нМ GM1 5 20.0 ± 7.2в'г
1 мкМ GM1 7 31.1 ± 9.1б'г
10 мкМ GM1 18 63.0 ± 3.3а-г
50 мкМ GM1 4 76.0 ± 3.3а-г
Примечание. Данные представлены как среднее ± 8.Е.И. Активность ЛДГ в среде инкубации определяли через 2 ч после действия Н2О2. Вычисляли увеличение высвобождения ЛДГ в среду инкубации в присутствии одной Н2О2, в присутствии Н2О2 и разных концентраций ОМ1, а также разницу в эффекте Н2О2 в присутствии и отсутствие ОМ1 в пробах. Отношение этой разницы к увеличению высвобождения ЛДГ в присутствии одной Н2О2 , которое принимали за 100%, составляло процент ингибирования ганглиозидом ОМ1 цито-токсического действия Н2О2.
Концентрация Н2О2 в пробах составляла 1 мМ. Различия достоверны а'б'в - по сравнению с эффектом одной перекиси, а -р < 0.01, 6 - р < 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.