БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 1, с. 68 - 78
УДК 577.151.35 +577.151.33 + 577.151.042
НИКОТИНАМИДАЗА ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ АРХЕИ Acidilobus saccharovorans: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
© 2014 г. Т.Н. Стеханова1*, Е.Ю. Безсуднова1, А.В. Марданов2, Е.М. Осипов1, Н.В. Равин2, К.Г. Скрябин2, В.О. Попов1
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2; факс: (495)954-2732, электронная почта: inbi@inbi.ras.ru, tstekh@yandex.ru 2 Центр «Биоинженерия» РАН, 117312 Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1; факс: (499)135-0571, электронная почта: office@biengi.ac.ru
Поступила в редакцию 30.08.13 После доработки 04.10.13
Никотинамидаза — фермент, участвующий в поддержании гомеостаза и рециркуляторном биосинтезе НАД+ у большинства прокариот, что делает его потенциальной мишенью лекарственной терапии. В геноме термофильной археи Acidilobus saccharovorans выявлен ген (ASAC 0847), кодирующий гипотетическую никотин-амидазоподобную гидролазу. Продукт экспрессии данного гена в Escherichia coli, NA_AS0847, являющийся гомодимером с молекулярной массой 46,4 кДа, выделен и охарактеризован как Fe^-содержащая никотинамидаза (kcat/Km = 427 мМ-1 • с-1)/пиразинамидаза (kcaa/Km = 331 мМ-1 • с-1). Фермент характеризуется высокой термофильностью (Топт = 90°, Ea = 30,2 ± 1,0 кДж/моль) и термостабильностью (Т1/2 (60°) = 180 мин, Т1/2 (80°) = 35 мин), активен в широком диапазоне pH с оптимумом при pH 7,5. Отличительной особенностью NA_AS0847 является присутствие в активном центре ионов Fe2+ вместо Zn2+, а также ингибирова-ние активности микромолярными концентрациями Zn2+. Проведенный анализ аминокислотных последовательностей гомологичных никотинамидаз архей позволил выявить новую консервативную последовательность металлсвязывающего мотива DXHXXXDXXEXXXWXXH.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: никотинамидаза, пиразинамидаза, архея, C-D-K каталитическая триада, металлсвя-зывающий мотив.
Никотинамидаза (Е.С. 3.5.1.19) — фермент, гидролизующий никотинамид до никотиновой кислоты и аммиака (рис. 1, а), принадлежит к семейству цистеиновых гидролаз. Ближайшими структурными гомологами никотинамидаз являются М-карбамоил-саркозин амидогидролазы (С8Иазе, Е.С. 3.5.1.59), изохоризматазы (Е.С. 3.3.2.1) и ряд белков (УсаС_ге1а1её) с неизвестной функцией.
Никотинамидазы, в отличие от С8Иа8е и изохоризматаз, — металлозависимые ферменты. Большинство из них содержат ион 2и2+ в активном центре. Механизм катализируемой реакции, роль и специфичность иона металла в катализе не были до последнего времени ясны и ак-
Принятые сокращения: С8Иаве — М-карбамоил-саркозин амидогидролаза; НАД+ — никотинамиддинукле-отид; а.о. — аминокислотные остатки; ДТТ — 1,4-дитиотре-итол.
* Адресат для корреспонденции.
тивно дискутировались [1—3]. Анализ структур комплексов фермента с субстратами и ингибиторами (РББ 3091, 3092, 3093, 3094, 2ШЛ, 2WT9, 3Я21, 3У8Б) позволил предложить вероятный механизм, согласно которому ионы металла непосредственно участвуют в катализе, осуществляя координацию, ориентацию и активацию молекул субстрата [3—5].
Никотинамидаза играет центральную роль в клеточном метаболизме прокариот и ряда эука-риот, участвуя в поддержании гомеостаза НАД+ путем регуляции активности сиртуинов, а также в рециркуляторном биосинтезе НАД+ [6].
У млекопитающих реализуется иной путь рециркуляции НАД+ без участия никотинамидазы с непосредственной конверсией никотинамида в никотинамидмононуклеотид. Отсутствие в геноме человека гена, кодирующего никотинами-дазу [7, 8], а также важность никотинамидазной активности для жизнедеятельности многих организмов, в том числе патогенных для человека
Рис. 1. Реакции, катализируемые никотинамидазами (а) и пиразинамидазами (б)
[9, 10], делают этот фермент потенциальной мишенью лекарственной терапии. Повышенный интерес к структурно-функциональным исследованиям никотинамидаз, особенно к выявлению структурных основ субстратной специфичности фермента, связан с обнаружением того факта, что никотинамидаза Mycobacterium tuberculosis, помимо природного субстрата никотина-мида, способна гидролизовать его синтетический аналог — противотуберкулезный препарат первого выбора пиразинамид. Продукт ферментативного превращения пиразинамида — пира-зиновая кислота — и является активной формой этого препарата (рис. 1, б) [11]. Было показано, что возникновение устойчивых к пиразинамиду штаммов M. tuberculosis обусловлено наличием у этих штаммов мутантных форм никотинамида-зы, утративших способность гидролизовать пи-разинамид [12]. В связи с этим возникает интерес к сравнительному изучению гомологичных никотинамидаз для выявления наиболее часто мутирующих сайтов [12]. Фермент также может представлять биотехнологический интерес как потенциальный компонент тест-систем для определения активности сиртуинов [13].
К настоящему времени исследованы в разной степени полноты никотинамидазы из Streptococcus pneumonia, M. tuberculosis, Pyrococcus hori-koshii, Acinetobacter baumanii, Saccharomyces cere-visiae, Oceanobacillus iheyensis, Leishmania infantum, в том числе на структурном уровне [1—3, 14-17].
В геноме термофильной археи A. saccharovo-rans [18] имеется ген (ASAC_0847), продукт которого (YP_003816284) гомологичен белкам, охарактеризованным на структурном и биохимическом уровнях как никотинамидазы/пирази-намидазы (23—65% идентичности). В настоящей работе приводятся анализ первичной структуры ряда гомологичных никотинамидаз и CSHase; биохимическая характеристика NA_As0847, продукта гетерологической экспрессии гена ASAC_0847 в E. coli; компьютерное моделирование 3D структуры NA_AS0847 на основе известной структуры из Thermoplasma acidophilum (PDB код 3EEF) [15].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клонирование, экспрессия, выделение и очистка.
Для амплификации гена никотинамидазы ASAC_0847с помощью ПЦР использовали прай-меры: ASAC_0847_BamHI (5'-TTGGATCCGT-GAGCGCTTTGAGG-3') и ASAC_0847_Hindin (5'-TTAAGCTTCATAGCTATGGCCTCGTC-3'), в качестве матрицы использовали геномную ДНК A. saccharovorans. Полученный ПЦР-фраг-мент обрабатывали рестриктазами BamHI и HindlII и клонировали в экспрессионном векторе pQE80L («Qiagen», Нидерланды). Клетки E. coli Rosetta-gami (DE3), несущие рекомбинантный экспрессионный вектор pQE80_ASAC0847, культивировали в среде LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл хлорамфеникола при 37° до середины экспоненциальной фазы роста (OD600 = 0 , 5). Экспрессия, индуцированная добавкой 1 мМ изопропил^^-1-тиогалактопи-ранозида, продолжалась 15 ч при 37°. Клетки собирали центрифугированием (10 000 g, 30 мин, 5°); гомогенизировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере (pH 7,5), содержавшем 200 мМ NaCl, 10% (v/v) глицерина, 10 мМ ß-меркаптоэтанол, 0,1% (v/v) Тритона Х-100, 1 мМ фенилметилсульфонил-фторид; разрушали с помощью френч-пресса (1000 psi). Гомогенат центрифугировали при 10 000 g 25 мин при 5°. Супернатант прогревали при 65° 10 мин, денатурированные балластные белки осаждали центрифугированием при тех же условиях. Супернатант наносили на аффинную колонку HiTrap Chelating HP («Amersham Pharmacia Biotech», США), уравновешенную буфером А (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 500 мМ NaCl; 20 мМ имидазол). Колонку тщательно промывали буфером А с добавлением 0,05% (v/v) Тритона Х-100, затем элюировали имидазол ом (линейный градиент 20—500 мМ) в буфере А. Фракции, содержавшие гомогенный целевой белок NА_As0847, объединяли, добавляли глицерин
до 50% и хранили при температуре —20°. Выход целевого белка составлял 30 мг с 1 л среды ферментации. Для последующих экспериментов белок переводили в буфер Б (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl) с использованием колонки HiTrap Desalting емкостью 5 мл («GE Healthcare», Великобритания). Гомогенность белковых фракций контролировали методом электрофореза в 12%-ном Ds-Na-ПААГ [19] (аппаратура для электрофореза «Bio-Rad», США). Олигомерный состав препарата NA_As0847 контролировали гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 10/300 («Amersham Pharmacia Biotech», США), уравновешенной буфером Б, предварительно прокалиброванной с помощью набора стандартных белков («Amersham Biosciences», США). Концентрацию белка в растворе определяли по методу Бредфорд [20].
Определение ферментативной активности. Активность NA_As0847 определяли по начальной скорости гидролиза никотинамида (или иного указанного субстрата). Условия проведения реакции: 2—3 мкг белка прединкубировали 3 мин при 60° в 1,5 мл буфера Б, реакцию начинали добавлением субстрата до концентрации 5—10 мМ, инкубировали смесь в течение 3—5 мин при 60° в герметичных виалах, ежеминутно шприцом отбирая аликвоты (0,2 мл) для определения содержания аммиака по стандартной методике с реактивом Несслера [21]. Результат корректировали с учетом неферментативного гидролиза субстрата, а также влияния добавок (при их наличии) на определение аммиака с реактивом Несслера.
Кинетические параметры Km и Kmax вычисляли, используя уравнение Михаэлиса—Ментен и программу OriginPro 7.5.
pH-зависимость ферментативной реакции. pH-зависимость ферментативной реакции исследовали в диапазоне pH 5—10,5, используя для определения активности следующие буферы: 0,1 М фосфат натрия (pH 5-7,5), 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5-8,5) и 0,1 М Gly/NaOH (pH 8,5-10,5), содержавшие 100 мМ NaCl.
Влияние добавок на активность фермента. Ферментный препарат NA_As0847 (0,1-0,2 мг/мл) инкубировали при комнатной температуре 20-30 мин в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5) с солями металлов, ЭДТА или ДТТ в указанных концентрациях (табл. 1). Аликвоты отбирали для определения ферментативной активности по описанной выше методике. NaCl добавляли непосредственно в буфер Б.
Ингибирование ионами Zn2+. 2-3 мкг NA_As0847 прединкубировали 3 мин при 60° в 1,5 мл буфера Б, содержавшего 1-6 мкМ ZnCl2. Реакцию начинали добавлением никотинамида (0,6, 1 или
2 мМ), далее ферментативную активность измеряли по описанной выше методике.
Температурный оптимум и термостабильность. Температурный оптимум определяли, проводя реакцию ферментативного гидролиза никоти-намида в буфере Б в диапазоне температур 40—98° в твердотельном термостате. Для исследования термостабильност
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.