научная статья по теме НИЗКАЯ ЭКСПРЕССИЯ AКТИВИНА А В НУЛЛИПОТЕНТНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «НИЗКАЯ ЭКСПРЕССИЯ AКТИВИНА А В НУЛЛИПОТЕНТНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА»

ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 4, с. 272-279

= ЭМБРИОГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

УДК 611-013;57.086.835;577.218

НИЗКАЯ ЭКСПРЕССИЯ AКТИВИНА А В НУЛЛИПОТЕНТНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА

© 2014 г. О. Ф. Гордеева

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 e-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 01.03.14 г.

Окончательный вариант получен 10.03.14

Факторы семейства TGFß играют важную роль в регуляции самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых и эмбриональных тератокарциномных клеток мыши и человека. Паттерны экспрессии сигнальных лигандов семейства TGFß и функциональная роль этих сигнальных путей значительно различаются в эмбриональных стволовых клеток мыши и человека, однако активность и функциональная роль этих факторов в эмбриональных тератокарциномных клетках исследованы недостаточно. Сравнительный количественный ПЦР-анализ экспрессии факторов семейства TGFß в эмбриональных стволовых, эмбриональных герминативных и эмбриональных те-ратокарциномных клетках мыши показал, что в эмбриональные тератокарциномные клетки экспрессируют более низкий уровень ActivinA, чем плюрипотентные стволовые клетки, но сходные уровни экспрессии факторов Nodal, Lefty1, TGFß1, BMP4 и GDF3. В нуллипотентных эмбриональных тератокарциномных клетках человека PA-1 большинство факторов семейства TGFß (ACTIVINA, NODAL, LEFTY1, BMP4 и GDF3) экспрессируется на более низком уровне, чем в эмбриональных стволовых клетках человека. Таким образом, в нуллипотентных эмбриональных тератокарцином-ных клетках мыши и человека значительно снижена экспрессия ActivinA по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками. Предположительно, эти различия могут быть связаны с изменением функциональной активности соответствующих сигнальных путей и дерегуляции пролифера-тивных и антипролиферативных механизмов в эмбриональных тератокарциномных клетках.

Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, тератокарцинома, плюрипотентность, АйМпА, сигнальные пути ТОБр.

DOI: 10.7868/S0475145014040053

Баланс процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток является основой го-меостаза самообновляющихся тканей. Нарушения механизмов, контролирующих самообновление и дифференцировку в стволовых клетках, вследствие различных мутаций могут приводить к их функциональным нарушениям или онкоген-ной трансформации в раковые стволовые клетки (Caisander et al., 2006; Gore et al., 2011; Hovatta etal., 2010; Urbach et al., 2009). Потенциально плюрипотентные стволовые клетки в эмбрионе, как и мультипотентные стволовые клетки во взрослых тканях, могут трансформироваться в опухолевые стволовые клетки при различных генетических и эпигенетических перестройках. Ранее опухолевые аналоги плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих — линии эмбриональных тератокарциномных клеток (ЭТК) — были выделены из тератом и тератокарцином у

разных млекопитающих и человека (Andrews etal., 1984; Andrews et al., 1985; Andrews, 1988; Martin et al., 1975; Zeuthen et al., 1980). По сравнению с плюрипотентными стволовыми клетками ЭТК имеют ограниченный потенциал к диффе-ренцировке in vitro и при развитии в химерных эмбрионах, в то время как пролиферативный потенциал недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток и ЭТК сходен (Гордеева и др., 2009; Andrews et al., 1984; Andrews et al., 1985; Andrews, 1988; Papaioannou et al., 1978; Rossant et al., 1982). Таким образом, в ЭТК происходит дерегу-ляция пролиферативных и антипролифератив-ных сигнальных и регуляторных механизмов, нарушающая их дифференцировку.

Известно, что плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих могут находиться в разных фазах плюрипотентного статуса — базовом и первичном статусах плюрипотентности (naïve/ground

НИЗКАЯ ЭКСПРЕССИЯ AKTИBИНA А

273

and primed states) (Nichols et al., 2009). Так, полученные из бластоцист эмбриональные стволовые клетки мыши и человека (мЭСК и чЭСК) в процессе адаптации in vitro стабилизируются в разных состояниях — в базовом и первичном статусе плюрипотентности. Механизмы сигнальной регуляции клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различаются, так как для поддержания самообновления мЭСК и чЭСК необходимы различные системы культивирования, включающие разные наборы сигнальных факторов (Лифанцева и др., 2013; Brons et al., 2007; Eiselleova et al., 2009; Na et al., 2010; Smith et al., 1988; Tesar et al., 2007; Vallier et al., 2005; Xu et al., 2001). Предыдущие исследования показали, что поддержание in vitro недифференцированных мЭСК и чЭСК достигается с помощью различных схем регуляций ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3 и BMP/Smad1/5/8 эндогенных ветвей TGFP сигна-линга (Greber et al., 2007; Greber et al., 2008; Na et al., 2010; Vallier et al., 2005). Необходимость экзогенной стимуляции или ингибирования этих сигнальных путей обусловлена различиями в паттернах эндогенной экспрессии факторов семейства TGFP и FGF2 в мЭСК и чЭСК (Лифанцева и др., 2013). В то же время статусы ЭТК мыши и человека (мЭТК и чЭТК) лишь частично соответствуют статусам их нормальных клеток-прототипов — ЭСК (Гордеева и др., 2011), а системы поддержания мЭТК и чЭТК не различаются. В свете полученных данных о роли паттернов эндогенной экспрессии факторов семейства TGFP в поддержании разных статусов плюрипотентности нормальных ЭСК встает вопрос о том, какие изменения в экспрессии факторов семейства TGFP в мЭТК и чЭТК могут оказывать влияние на изменение их потенциала к дифференцировке, а также существуют ли различия в паттернах экспрессии факторов семейства TGFP в мЭТК и чЭТК, по аналогии с их нормальными клетками-аналогами. Поскольку эти вопросы практически не исследованы, был проведен сравнительный количественный анализ экспрессии факторов семейства TGF Р в ЭСК и ЭТК мыши и человека.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеток. В работе были использованы линии мЭСК R1 и мЭГК EGC-10 любезно предоставленные А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). Линия чЭСК ESM01 была любезно предоставлена Г.П. Георгиевым и С.Л. Киселевым (Институт биологии гена РАН, Москва). Линии мЭТК F9 и P19, а также чЭТК PA-1 были получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

ЭСК и ЭГК мыши культивировали в среде DMEM, содержащей 1 мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот ("HyClone", США), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола ("Sigma", США) и 15% заменителя фетальной сыворотки (Knockout Serum Replacement, "Gibco", США) и фактор ингибирова-ния лейкемии (leukemia inhibitory factor, LI F, 10 нг/мл, "Sigma"). Недифференцированные чЭСК ESM01 поддерживали на фидере из эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), инактивиро-ванных митомицином С ("Sigma"), в среде такого же состава, как и для мЭСК, но с добавлением основного фактора роста фибробластов человека (bFGF, 10 нг/мл, "Invitrogen", США) вместо LIF. Линии ЭTK мыши и человека культивировали в той же среде, что и ЭСК, но без добавления факторов роста.

Анализ генной экспрессии. Анализ экспрессии факторов семейства TGFß в плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клетках мыши и человека проводили с помощью ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР). Ъэтальную РНК выделяли из клеток, используя Trizol ("Invitrogen") в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию тотальной РНК в образцах определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 8000 (ThermoScientific, США). Все образцы тотальной РНК обрабатывали ДНКазой (TurboDNA kit, "Ambion", США) для предотвращения контаминации геномной ДНК. Для синтеза кДНК-биб-лиотек использовали 1 мкг тотальной РНК каждого образца. Синтез кДНК библиотек проводили с использованием обратной транскриптазы RevertAid Reverse Transcriptase M-MuLV и олиго (dT)18 праймеров ("Fermentas", Литва).

Количественный РВ-ПЦР анализ генной экспрессии проводили на амплификаторе "Applied Biosystems 7500" (США) с использованием набора для проведения РВ-ПЦР с красителем EVA Green ("Синтол", Россия) по следующему протоколу: предварительная денатурация: 94°C — 5 мин; отжиг праймеров и элонгация: 61°C — 1 мин; денатурация: 94°C — 15 с, 40 циклов. Для анализа были использованы праймеры, которые были сконструированы ранее на основе данных о структуре исследуемых генов в базах данных GenBank и Ensemble (табл. 1 и 2). Каждый эксперимент был проведен в трех повторах. Уровень экспрессии генов в каждом образце нормализовали к уровню экспрессии гена гипоксантин-гуанин фосфорибозил транс-феразы (Hprt/HPRT). Для анализа относительных уровней экспрессии генов использовали программу ABI Relative Quantification Study software (Applied Biosystems, США). При анализе относительных уровней экспрессии генов семейства факторов TGFß в каждом типе клеток уровень экспрессии гена Hprt/HPRT принимали за одну относительную единицу, а уровень экспрессии всех остальных генов в образце рассчитывали по

Таблица 1. Структура праймеров для РВ-ПЦР-анализа генной экспрессии в мЭСК, мЭГК и мЭТК

Ген № Последовательности Прямой и обратный праймеры Размер, п.о.

ActivinA NM_002192 5'tggagcagacctcggagatcatcac3' 5'ttggtcctggttctgttagccttgg3' 160

Nodal NM_013611 5'gcgagtgtcctaaccctgtg3' 5'atgctcagtggcttggtc3' 136

Lefty1 NM_010094 5 'tgtgtgctctttgcttcctctg3' 5'gcagtgaacaatatgaaggacagag3' 123

Tgfb1 NM_011577 5'caattcctggcgttaccttgg3' 5'ccctgtattccgtctccttgg3' 120

Bmp4 NM_007554 5'tctggtctccgtccctgatg3' 5'cgctccgaatggcactacg3' 175

Gdf3 NM_008108 5'gatgagtgtgggtgtgggtag3' 5'gtccgattcaagagagcataagc3' 109

Hprt NM_013556 5'cgttgggcttacctcactgctttc3' 5'ggtcataacctggttcatcatcgctaatc3' 150

Таблица 2. Структура праймеров, используемых для РВ-ПЦР-анализа в чЭСК и чЭТК

Ген № Последовательности Прямой и обратный праймеры Размер, п.о.

ACTIVINA NM_002192 5'agggcagaaatgaatgaacttatgg5' 5'gaggcggatggtgactttgg5' 198

NODAL NM_018055 5'tcaactgtgtcggaaggtcaag3' 5'tcggtggggctggtaacg3' 190

LEFTY1 NM_020997 5'tcattgtttacttgtcctgtcactg3' 5'agtctttattatctggattggggatgc3' 116

TGFß1 NM_000660 5'tggacatcaacgggttcactac3' 5'gcacgcagcagttcttctcc3' 186

BMP4 NM

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком