ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 184-189
УДК 581.1
НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ И СУБСТРАТНАЯ ИНДУКЦИЯ ГЕНА Л9-ДЕСАТУРАЗЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ТЕРМОФИЛЬНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ Synechococeus vulcanus
© 2004 г. Д. Ä. Лось
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 16.06.2003 г.
Показана индукция гена desC, кодирующего единственную ацил-липидную десатуразу термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus, при снижении температуры, а также при оптимальной температуре с добавлением в среду культивирования субстрата для соответствующего фермента -стеариновой кислоты (18 : 0). При 55° и 45°С транскрипция гена начиналась с положения -59, считая от стартового кодона трансляции. При добавлении 18 : 0 обнаруживались два специфических пула мРНК, один из которых по размеру соответствовал транскрипту, присутствовавшему при 55° и 45°С, а второй характеризовался большим размером. Определение точек начала транскрипции показало, что 18 : 0 индуцировала транскрипцию также в положениях -163 и -169. Дополнительные точки начала транскрипции локализованы в кодирующей последовательности гена hemN, предшествующего гену desC. Таким образом, экспрессия гена desC при снижении температуры и его индукция субстратом, видимо, контролируется различными промоторными последовательностями.
Synechococcus vulcanus - десатуразы- низкотемпературная регуляция - субстратная регуляция -экспрессия гена
Низкотемпературная индукция генов десату-раз жирных кислот в мезофильных организмах является хорошо изученным феноменом [1-3]. Считается, что при снижении температуры происходит снижение текучести биологических мембран и при этом дополнительная десатурация ЖК в липидах мембран позволяет компенсировать уменьшение текучести, таким образом способствуя нормальному функционированию мембрано-связанных энергетических белковых комплексов [3-5]. Системы передачи низкотемпературного сигнала, приводящие к индукции генов десатураз и состоящие из сенсорной гистидинкиназы и фос-форилируемого ею регулятора ответа, были идентифицированы для мезофильной цианобактерии Synechocystis [6-8] и Грам-положительной бактерии Bacillus subtilis [9].
Субстратная индукция десатураз ЖК была показана только на клетках млекопитающих [1013] и дрожжей [14]. В последнем случае при добавлении в среду культивирования стеариновой кислоты авторы наблюдали усиление транскрипции Д9-стеароил-КоА-десатуразы. Видимо, этот
Сокращение: т.п.н.-тысяча пар нуклеотидов.
Адрес для корреспонденции: Лось Дмитрий Анатольевич.
127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии
растений РАН. Факс: 07 (095) 977-93-72; электронная почта:
losnet@ippras.ru
эффект связан с эффективным включением насыщенных ЖК в липиды мембран и необходимостью их десатурации, поскольку высокое содержание таких ЖК приводит к нарушению функционирования дыхательных цепей [15].
Поиск регуляторных факторов в этом случае пока не дал результатов, однако у некоторых организмов удалось определить последовательности ДНК - цис-элементы, предположительно связывающие белки, регулирующие транскрипцию генов десатураз [16, 17].
В данной работе мы исследовали транскрипцию гена desC, кодирующего единственную десатуразу ЖК в клетках термофильной цианобактерии БупесНососсш vulcanus, под влиянием пониженной температуры, а также при добавлении стеариновой кислоты, которая в составе мембранных липидов является субстратом для этого фермента.
МЕТОДЫ
Штамм БупесНососсш vulcanus (¡РРАБ В-453) был получен из Коллекции микроводорослей Института физиологии растений РАН. Клетки выращивали при оптимальной температуре 55°С, постоянном освещении люминесцентными лампами при интенсивности света 59-70 мкмоль квантов/(м с) и барботировании газовоздушной смесью с 2%-ным содержанием С02 [18, 19].
Выделение РНК и нозерн-блоттинг проводили по ранее описанной методике [19, 20].
Определение стартовых точек транскрипции проводили, как описано ранее [20], с использованием синтетических олигонуклеотидов SV1: 5'-AGGTCTGGGGTTCGAATTC и SV2: 5'-AATG-GCCTTAGAAAATGTCCT в качестве праймеров для обратной транскрипции. В экспериментах по удлинению праймеров использовали по 5 мкг общей РНК на одну реакцию. Обратную транскрипцию проводили с использованием фермента Su-perScriptll ("New England Biolabs", США). Секве-нирование проводили с использованием тех же праймеров и набора Sequenase deaza-dGTP ("US Biochemicals", США). В качестве матрицы для секвенирования использовали плазмиду pUC19, содержащую вставку геномной ДНК S. vulcanus размером 6 т.п.н. и несущую ген desC с фланкирующими последовательностями [19].
Нуклеотидные последовательности, представленные в данной работе, депонированы в базу данных GenBank под номерами U90417 (desC) и AF027176 (hemN).
(a)
55°C _45°C_
15 30 60 120 мин
desC
16S pPHK
1 2 3 4 5
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы показали, что транскрипция гена desC Б. уикапш индуцируется в течение 12 ч при снижении температуры с 55° до 45° или 35°С [19]. Параллельно наблюдалось накопление соответствующего фермента, за которым следовало увеличение количества мононенасыщенных ЖК, в основном 18 : 1 [18, 19]. Однако в этих работах мы изучали изменения количества специфической мРНК, соответствующего белка и ЖК в течение 24-48 ч, отбирая экспериментальные образцы с интервалами в 2-12 ч. В данной работе мы исследовали экспрессию desC при снижении температуры в пределах 2 ч с целью выяснения кратчайших временных интервалов, в течение которых происходит индукция гена. Как видно на рис. 1, индукция desC наблюдается уже через 15 мин после снижения температуры с 55 до 45°С. Через 30-60 мин количество мРНК desC увеличивается в 8-10 раз, а через 2 ч наблюдается снижение количества транскрипта, что свидетельствует о транзиентной природе индукции гена desC.
Рис. 1 также показывает, что мРНК desC представлена в форме транскрипта одного размера. Эти данные позволяют предположить, что транскрипция desC начинается с одного промотора при оптимальной (55°С) и пониженной (45°С) температурах. При низкотемпературной индукции может быть активирован и альтернативный промотор. Однако при этом, он должен быть локализован поблизости от конститутивного промотора, поскольку разницы в размерах транскриптов,
«10
о
я н о
О
s e
d ® 5
Рч 5
О я
¡3
о я
и
ч
о «
0 15 30 60 120 Время инкубации при 45°С, мин
Рис. 1. Нозерн-блоттинг анализ транскрипции гена desC при снижении температуры. а - клетки выращивали при 55°С и постоянном освещении 70 мкмоль квантов света (м с) до оптической плотности 0.5 при 750 нм (1), после чего клетки переносили на 45°С и продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 15 (2), 30 (3), 60 (4) и 120 (5) мин. Выделенную из клеток общую РНК разделяли электрофорезом в 1.2%-ном агарозном геле, содержащем формальдегид, переносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с пробой, соответствующей гену desC Б. уи1сапт [19]. В лунки геля наносили по 10 мкг общей РНК. Для проверки равномерности нанесения РНК на гель после гибридизации с пробой desC, мембраны отмывали от радиоактивной пробы и гибридизовали их снова с пробой, соответствующей 168 рРНК (а, нижняя панель); б - количественная оценка динамики транскрипции гена desC по результатам трех независимых экспериментов.
1
(a) 55°C
desC
10
(N 0
8 8 8
1 1 1
+ + +
(б)
К
-
<N
8
+
0 8
+
Рис. 2. Нозерн-блоттинг анализ транскрипции гена desC при добавлении ЖК.
а - клетки выращивали при 55°С и постоянном освещении 70 мкмоль квантов света (м с) до оптической плотности 0.5 при 750 нм (1), после чего к клеткам добавляли по 1 мМ олеата натрия (2), ленолеата натрия (3) или стеарата натрия (4) и продолжали инкубацию при 55°С в течение 1 ч. Выделенную из клеток общую РНК разделяли электрофорезом в 1.2%-ном ага-розном геле, содержащем формальдегид, переносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с пробой, соответствующей гену desC S. vulcanus [19]. В лунки геля наносили по 10 мкг общей РНК; б - количественная оценка транскрипции гена desC по результатам трех независимых экспериментов.
синтезируемых при разных температурах, не наблюдалось (рис. 1).
Известно, что экспрессия генов десатураз ЖК может индуцироваться не только при снижении температуры, но также при оптимальной температуре, если на клетки воздействовать агентами, повышающими текучесть липидных мембран [21, 22].
Увеличение ферментативной активности десатураз может быть вызвано при оптимальных температурах роста при добавлении в среду культивирования соответствующих субстратов. Так, в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способных синтезировать только мононенасыщенные ЖК, увеличение активности Д9-стеароил-КоА-десатуразы наблюдали при добавлении к клеткам стеариновой кислоты [14]. Напротив, добавление олеиновой кислоты, являющейся продуктом активности Д9-десатураз, приводило к снижению активности Д9-десатураз дрожжевых клеток [14]. Такая субстратная регуляция предполагает, что натриевые соли ЖК, использовавшиеся в экспериментах, поглощались клетками и конвертировались в формы ацил-КоА, являющиеся, соответственно, субстратом или продуктом десатурации.
Мы попытались выяснить, не влияют ли избыточные количества субстрата или продукта непосредственно на экспрессию гена Д9-десатуразы в клетках S. vulcanus, и если влияет, то какие регу-ляторные элементы могут быть потенциальными участниками такой регуляции. Для этого к клеткам, растущим при 55°С, добавляли натриевые соли стеариновой (18 : 0), олеиновой (18 : 1Д9) или линолевой кислот (18 : 2Д9, 12) (рис. 2). Как видно из рисунка, инкубация клеток в течение 1ч в присутствии 18 : 1 приводила к снижению количества мРНК desC. При внесении в среду культивирования 18 : 2 наблюдалось некоторое увеличение количества мРНК desC. Однако поскольку клетки S. vulcanus, имеющие лишь одну Д9-десатуразу, сами по себе не способны синтезировать диеновые кислоты, возможная регуляторная роль 18 : 2 остается неизвестной, а полученный результат не поддается какой-либо внятной интерпретации.
Наиболее яркое индуцирующее действие на транскрипцию гена desC ока
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.