ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81.083.18(571-285.2)
НОВАЯ АЛКАЛОФИЛЬНАЯ НЕСЕРНАЯ ПУРПУРНАЯ БАКТЕРИЯ RHODOBACULUM CLAVIFORME GEN. NOV., SP. NOV. © 2015 г. И. A. Брянцева, В. А. Гайсин, В. М. Горленко
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 22.07.2014 г.
Два штамма (В7-4 и B8-2) алкалофильных несерных пурпурных бактерий (НПБ) выделены из умеренно соленых степных содовых озер Забайкалья с рН выше 9.0. Бактерии были подвижны, имели полиморфные клетки (от коротких палочек до длинных веретенообразных клеток) размером 2.0—3.2 х 9.6—20.0 мкм. Внутриклеточные мембраны везикулярного типа располагались преимущественно по периферии клеток. Микроорганизмы содержали бактериохлорофилл а и каро-тиноиды как сфероиденовой, так и спириллоксантиновой серий. Фотосинтетический аппарат был представлен светособирающими комплексами LH2 и LH1. Рост штаммов происходил в присутствии органических соединений в аэробных условиях в темноте или в анаэробных условиях на свету. Способность к фото- и хемоавтотрофному росту не выявлена. Ген cbbl, участвующий в синтезе РуБисКО, не обнаружен. Оптимальный рост обоих штаммов происходил при концентрации NaCl 2% (диапазон роста 0.5—4%), рН 8.0—8.8 (диапазон 7.5—9.7) и температуре 25—35°С. Содержание Г + Ц в ДНК новых штаммов было 67.6—69.8 мол. %. Парное сравнение последовательностей нуклеотидов гена 16S рРНК штаммов В7-4 и B8-2 выявило, что они принадлежали к одному виду (99.9% сходства) и были наиболее близки к алкалофильной аэробной бактериохлорофилл а содержащей аноксигенной фототрофной бактерии (АФБ) Roseibacula alcaliphilum De (95.2%), а также к штаммам НПБ Rhodobaca barguzinensis VKM B-2406T (94.2%) и Rbc. bogoriensis LBB1T (93.9%). Близкий уровень сходства новых штаммов установлен также с видом НПБ Rhodobacter veldkampii DSM 11550Т (94.8%) и аэробными бактериохлорофилл а содержащими бактериями Roseinatronobacter monicus ROS 35Т и Roseicitreum antarcticum ZS2-28T (93.5 и 93.9% соответственно). Новые штаммы описаны как новый род и новый вид НПБ Rhodobaculum claviforme gen. nov., sp. nov. с типовым штаммом B7-4T (ВКМ В-2708, LMG 28126) семейства Rhodobacteriaceae.
Ключевые слова: несерные пурпурные бактерии (НПБ), таксономия, экстремофилия, алкалофилия, содовые озера, Ё.койоЬасы1ыт с1ау1/огте.
Б01: 10.7868/80026365615020020
Несерные пурпурные бактерии (НПБ) являются весьма неоднородной группой микроорганизмов с точки зрения филогении и особенностей их физиологии [1]. Они принадлежат к а- и в-ProteoЬacteria, обладают разнообразной морфологией, размножаются делением или почкованием. Различные виды имеют фотосинтетические мембраны везикулярного или ламеллярного типа, содержат пигменты бактериохлорофилл а или Ь и каротиноиды спириллоксантиновой или сфероиденовой серий [2].
В настоящее время известно пять алкалофиль-ных видов НПБ, которые выделены из содовых озер с разной степенью минерализации. Все они принадлежат к а-Рго1еоЬас1епа семейства Ккойо-Ьа^епасеае: КкойоЬаса Ьogoriensis [3], ЯЬс. Ьаг£Ы£1п-
1 Автор для корреспонденции (е-шаП: vgorlenko@mail.ru).
ensis [4], ИыЬпЬа^епыт ро1утогркыт [5], Екойоуы-1ыт steppense и Яуы. tesqыicola [6, 7].
Большинство видов НПБ хорошо растут анаэробно фотогетеротрофно за счет использования различных источников органического углерода. Некоторые виды способны использовать сульфид в качестве донора электронов при аноксигенном фотосинтезе и в этом отношении сходны с пурпурными серобактериями. Показано, что большинство НПБ способно к фотоавтотрофному росту с использованием молекулярного водорода. Многие виды НПБ также способны к хемогетеро-трофному росту в темноте в микроаэробных или аэробных условиях за счет дыхания. Лишь некоторые виды, такие как ШойоЬаса 8рр., КыЬпЬа^е-гшт ро1утогркыт и СНагопот^гоЬшт атЫрко-ШгорЫсыт, предпочитают расти аэробно в темноте [8], не утратив способность к анаэробному фототрофному росту. У этих видов не обнаруже-
7
225
ны ферменты автотрофной фиксации углекислоты посредством цикла Кальвина. Эта физиологическая особенность сближает их с аэробными бактериохлорофилл-а содержащими бактериями.
В данной работе исследованы два новых штамма алкалофильных бактерий, содержащих бакте-риохлорофилл а. Оба штамма лучше росли на органических субстратах аэробно в темноте, но также были способны к анаэробному фотогетеротрофному росту. Оба изолята оказались близки между собой по фенотипическим и филогенетическим признакам и идентифицированы как два штамма нового рода и вида семейства Rhodobacteriaceae: Rhodobaculum claviforme gen. nov., sp. nov.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и культивирование. Два штамма НПБ были выделены из умеренно соленых степных содовых озер Доронинское и Зун Торей (Юго-Восточная Сибирь, Россия). Выделение и культивирование НПБ проводили на среде следующего состава (г/л): NH4Cl - 0.4; KH2PO4 - 0.5; MgCl2 - 0.2; Na2SO4 - 0.5; KCl - 0.5; NaCl - 20; NaHCO3 - 5; дрожжевой экстракт - 1; Na ацетат -1; Na пируват - 1; бакто пептон - 1; витамин В12 -20 мкг/л; 1 мл/л раствор микроэлементов [9]. Раствор микроэлементов имел следующий состав (г/л) трилон В - 5; FeSO4 ■ 6H2O - 2; ZnSO4 ■ 7H2O - 0.1 MnCl2 ■ 4H2O - 0.03; H3BO3 - 0.3; CoCl2 ■ 2H2O - 0.2 CuCl2 ■ 2H2O - 0.03; NiCl2 ■ 6H2O - 0.02; Na2MoO4 • • 2H2O - 0.03. pH 3.0-4.0. Растворы микроэлементов и NaHCO3 (10%) готовили и стерилизовали отдельно в 50-100-мл флаконах с завинчивающимися крышками при 0.5 атм и добавляли в основную среду перед внесением инокулята в необходимом количестве. Основную среду в 0.5-1 л колбах стерилизовали при 1 атм. рН готовой среды составлял 8.0.
Чистые культуры штаммов получали многократным последовательным пересевом отдельных колоний, выросших в столбиках агаризован-ной среды (0.8% агара) при освещенности 2000 лк и температуре 25-35°C. На жидких средах чистые культуры выращивали анаэробно на свету в стеклянных флаконах с завинчивающимися крышками. Также культуры выращивали на поверхности чашек Петри (2% агара) и в 50-100 мл флаконах аэробно в темноте.
Морфология и тонкое строение. Морфологию бактериальных клеток изучали в световом ("Olympus BX 41", Япония) и электронном ("Jeol JEM-100C", Япония) микроскопах. Целые клетки контрастировали 1% раствором фосфоволь-фрамовой кислоты. Ультратонкие срезы получали согласно описанной ранее процедуре [10].
Пигменты. Спектры поглощения пигментов записывали на спектрофотометре СФ-56 ("ЛО-
МО", Россия) как в целых клетках (клетки суспендировали в 50% растворе глицерина), так и в ацетон-метаноловых (7 : 2) экстрактах.
Анализ состава каротиноидов бактерий проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [4].
Изучение физиологии. Для определения фото-трофного роста штаммов в гетеротрофных условиях разных субстратов использовали минеральную среду c небольшим количеством дрожжевого экстракта (0.05 г/л) в качестве фактора роста. Тестируемые органические вещества (5% растворы) готовили и стерилизовали отдельно при 0.5 атм и вносили в концентрации 0.5 г/л. Потребность исследуемых микроорганизмов в неорганических донорах электронов, а также их рост при разных значениях рН и концентрациях NaCl изучали в основной среде, параметры которой варьировали в соответствии с задачами эксперимента [10]. Рост культур определяли на фотометре КФК-3 (Россия) в стационарной фазе роста по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 650 нм.
Содержание S2O3 , SO3 и H2S + HS- определяли раздельным йодометрическим титрованием [11].
Анализ состава жирных кислот. Состав клеточных жирных кислот анализировали методами хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. 5 мг сухой биомассы клеток обрабатывали 0.4 мл раствора 1 N хлористого водорода в метаноле при 80°С в течение 3 ч (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали гексаном и вводили в газовый хроматограф системы Шерлок ("Microbial identification system, MIDI Inc.", США) [12].
Молекулярно-генетические исследования. Клеточную ДНК полученных чистых культур штаммов выделяли методом Мармура [13]. Определение пар нуклеотидов Г + Ц в составе ДНК осуществляли методом оптической реассоциации [14].
Для проведения амплификации и секвенирова-ния гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные праймеры 27f и 1492r [15]. Для амплификации фрагмента гена cbbL использовали праймеры согласно работе Спиридоновой и соавт.
[16]. Секвенирование продуктов амплификации проводили по Сэнгеру с помощью набора Big Dye Terminator v. 3.1 на автоматическом секвенаторе ABI 3730 ("Applied Biosystems, Inc.", США) согласно инструкциям производителя. Последовательности редактировали с помощью программы BioEdit
[17]. Проверку последовательностей на наличие химерных ставок проверяли с помощью программы Pintail 1.0 [18]. Филогенетический анализ и построение дендрограмм по методу Maximum-Likelihood проводили с помощью программного пакета MEGA 5.1 [19].
Депонирование нуклеотидных последовательностей. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности фрагментов генов 168 рРНК штаммов В8-2 и В7-4 были депонированы в базу данных GenBank под номерами КМ077018 и КМ077019 соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика мест выделения штаммов.
Штамм бактерий В7-4 был изолирован в чистую культуру в 2007 г. из пробы прибрежного мата, сформированного на поверхности ила стратифицированного содового озера Доронинское (51°25' N 112°28' Е) с минерализацией воды 32 г/л и рН 9.72. Культура бактерий штамма В8-2 получена из пробы грунта бессточного соленого озера Зун Торей (50°04' N , 115°48' Е), входящего в систему Торей-ских озер. Наибольшая глубина озера — 7 м. Минерализация озера 7 г/л, рН 9.5.
Морфология и тонкое строение. Клетки бактерий штаммов В7-4 и В8-2 имели полиморфную форму (веретеновидные клетки, короткие и вытянутые палочки) размером 2.0—3.2 х 9.6—20.0 мкм (рис. 1а, 1б). Клетки, выросшие в аэробных условиях, проявляли полиморфизм в большей степени (рис. 1б). Большинство клеток были неподвижны, однако в первичных посевах при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.