ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 4, с. 571-578
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
НОВАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ПОВЫШЕННОГО СИНТЕЗА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 В РАСТЕНИЯХ
© 2015 г. Н. С. Захарченко*, Н. И. Стрижов**, Л. А. Школьная***, С. В. Пиголева*, А. А. Лебедева*, Е. Б. Рукавцова*, О. В. Фурс*, Т. В. Шевчук*, О. В. Дьяченко*, Я. И. Бурьянов*
*Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл.
***Общество с ограниченной ответственностью "Пущинскиелаборатории",
Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 12.11.2014 г.
Ген антимикробного пептида цекропина Р1 (СР1) встраивали в векторную плазмиду рРСУ91 под контролем промотора 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ 358), содержащего 4 энхан-серных последовательности СаМУ 358 и нетранслируемую лидерную последовательность О РНК вируса табачной мозаики. С помощью полученного рекомбинантного вектора проведена агробак-териальная трансформация растений табака (Шсойапа tаЬасит Ь.) сорта Самсун. Присутствие гена СР1 в геноме растений подтверждено методом полимеразной цепной реакции. Экспрессия гена СР1 в трансгенных растениях доказана вестерн-блот анализом и тестированием антибиотической активности растительных экстрактов. Уровень синтеза цекропина Р1 в различных линиях составлял 0.02—0.2% от общего растворимого белка листьев растений. Трансгенные растения проявляли по сравнению с контрольными растениями повышенную устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам и к окислительному стрессу. Показано, что способность трансгенных растений экспресси-ровать цекропин Р1 передавалась потомству.
Ключевые слова: Мсойапа 1аЬасит — цекропин Р1 — агробактериальная трансформация — устойчивость к фитопатогенам
Б01: 10.7868/8001533031504020Х
ВВЕДЕНИЕ
Создание и использование эффективных векторов для экспрессии новых генов в растительных клетках входит в число актуальных задач получения трансгенных растений-продуцентов ценных биологических веществ. Экспрессия антимикробных пептидов в трансгенах является одним из перспективных методов повышения устойчиво -сти сельскохозяйственных растений к заболеваниям, вызываемых фитопатогенами [1, 2]. Антимикробные пептиды являются интегральной ча-
Сокращения: СОД — супероксиддисмутаза; С — цефатоксим; СаМУ 358 — промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ); СР1 — цекропин Р1; Нт — гигромицин В; hpt — ген гигромицинфосфотрансферазы; рпо8 — промотор гена нопалинсинтазы агробактерий.
Адрес для корреспонденции: Захарченко Наталья Сергеевна. 142290 Московская обл., Пущино, Проспект Науки, 6. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; электронная почта: 2па1а 2004@rambler.ru
стью врожденной иммунной системы всех многоклеточных организмов и обладают широким спектром бактерицидной и фунгицидной активности [3, 4]. Известно более 100 таких соединений, характерные свойства которых — суммарный положительный заряд и амфифильность. В настоящее время имеется много работ, в которых были получены устойчивые к патогенам трансгенные растения, синтезирующие антимикробные пептиды. В основном исследованы трансгенные растения, экспрессирующие гены дефен-зинов и цекропинов насекомых [5, 6]. Защитный эффект исследованных пептидов зависит от уровня экспрессии трансгенов в различных видах и сортах растений и различной скорости их деградации эндогенными пептидазами.
Ранее мы получили растения табака и картофеля с геном цекропина Р1 под контролем стандартного промотора СаМУ 358, содержащего один эн-хансерный домен. В растениях отмечалась ста-
бильная экспрессия цекропина на уровне 0.002% от общего растворимого белка листьев [7, 8]. Увеличение экспрессии антимикробных пептидов в трансгенных растениях может значительно повысить их сопротивляемость фитопатогенным микроорганизмам и позволит рассматривать такие растения в качестве продуцентов этих соединений.
Целью настоящей работы было повышение синтеза цекропина Р1 (СР1) [9] в растениях с помощью новой экспрессионной системы, в которой ген СР1 находится под контролем "суперпромотора" CaMV 35S, содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируе-мую лидерную последовательность Q РНК вируса табачной мозаики [10]. Проведен физиолого-биохимический анализ полученных трансгенных растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовали растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Семена стерилизовали 1.5 мин в 70% этаноле, затем 2 мин в 2% растворе гипохлорита натрия и промывали 3 раза по 10 мин в стерильной дистиллированной воде. Семена проращивали на безгормональной среде МС [11], содержащей 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (рН 5.8) и стандартный набор солей. Растения культивировали при температуре 22—24°C, 16-часовом дне и освещенности 2 клк.
Штаммы фитопатогенов. В работе использовали бактериальный фитопатогенный штамм Erwinia carotovora subsp. carotovora В15, полученный из Horticulture Centre (Канада) [12] и грибной фитопатоген Sclerotinia sclerotiorum, полученный из ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта (Краснодар).
Конструирование плазмиды для трансформации растений. В качестве источника целевого гена в работе использовали полученную ранее плазмиду pET21d, которая содержит структурную часть искусственного гена цекропина Р1 (СР1), кодирующую аминокислотную последовательность зрелой формы СР1 [9]. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора QIAGENR Plasmid Midi Kit (25) ("QIAGEN GmbH", Германия). ПЦР гена СР1 проводили с праймерами ATGGTGGATC-CTAGCGCGGGCCGCCCTGAATCGC (f) и ACTGAGGATCCACCATGGGCTCTTGGCTGTC-TAAA (r). Полученный ПЦР-продукт встраивали в вектор pPCV91 с суперпромотором CaMV 35S, содержащим 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируемую лидерную последовательность Q РНК вируса табачной мозаики. Для создания "липких" концов для лигирования проводили гидролиз векторной ДНК pPCV91 и гена, выделенного из геля после ПЦР с фермен-
том BamHI ("Fermentas", США). Лигирование ДНК вектора pPCV91 и гена СР1 проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 ("New England BioLabs", Великобритания). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5a [13]. Селекцию колоний проводили на среде LB [14] с 50 мкг/мл карбенициллина. Из карбенициллин-резистентных колоний выделяли ДНК и определяли присутствие гена СР1 с помощью ПЦР-анализа. Автоматическое секвени-рование и компьютерный анализ ПЦР-продукта проводили на автоматическом секвенаторе API PRISM 310 Genetic analyzer ("Applied Biosystems", США), используя набор ABI PriSM® Big-DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit v3.0 ("Applied Biosystems", Германия).
Перенос вектора pPCV91 с геном СР1 в штамм агробактерий CBE21(pTiBo542) [15] проводили методом прямой трансформации с использованием жидкого азота [16]. Агробактерии, содержащие вектор pPCV91::CP1 с геном цекропина Р1 и селективным геном устойчивости к гигромицину hpt, использовали для трансформации растений.
Трансформация растений. Трансформацию растений проводили методом инокуляции листовых дисков агробактериями [17]. После трансформации экспланты помещали на селективную среду МС [11], содержащую 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК, 10 мг/л гигромицина B (Hm) и 500 мг/л цефаток-сима (С!) Через 2—3 недели на эксплантах наблюдали регенерацию побегов. В каждом опыте в одну чашку Петри помещали по 10 эксплантов, общее количество чашек в опыте — 10—15. Выросшие на селективной среде побеги табака анализировали и в дальнейшем выращивали в теплице в стерилизованной почвенной смеси торф : песок (1:1 по объему) при 22—24°C, относительной влажности воздуха 60—70% и освещенности 4 клк.
Выделение ДНК из листьев табака. Для ПЦР
анализа трансгенных растений ДНК выделяли из молодых листьев по методу Edwards [18].
Вестерн-блот анализ. Для вестерн-блот анализа получали белковый экстракт листьев [2]. Электрофорез проводили в трициновой системе ДСН-ПААГ, белки переносили на нейлоновую мембрану PDVF ("Amersham Pharmacia Biotech", Великобритания) [19]. Иммуноферментный анализ СР1 проводили с помощью полученных к этому синтетическому пептиду кроличьих поликлональных антител и антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена. Синтетический СР1 был получен методом твердофазного синтеза. Проявку мембраны производили с помощью хемилюминесцентной системы ECL ("Pierce", США).
Биотесты с экстрактами из трансгенных растений. Антибактериальную активность экстрактов трансгенных растений определяли с помощью
биотеста, оценивая ингибирование роста клеток E. coli D22, дефектных по компонентам липосаха-ридной оболочки [20]. Для этого из листьев анализируемых растений получали экстракты [17], центрифугировали их 20 мин при 10000 g, и су-пернатант использовали для определения в нем антибактериальной активности. Экстракты, содержащие равное количество общего белка из листьев трансгенных и контрольных (нетрансфор-мированных) растений, вносили в лунки диаметром 5 мм, приготовленные в 1.5% LB-агаре с бактериями (108 клеток/мл). Агаровые блоки инкубировали 8 ч при 4°C для диффузии экстрактов в агар, затем блоки переносили на 25°C и через 2 суток измеряли чистые зоны вокруг лунок. Каждый опыт проводили с одним листом среднего яруса растения в трех биологических повторно-стях. Радиус чистой зоны вокруг лунки служил показателем ингибирования роста бактерий. Количественную оценку содержания СР1 в экстрактах трансгенных растений проводили сравнением со стандартными концентрациями синтетического СР1 [7].
Биотесты на изолированных листьях и растениях. Для анализа устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам молодые листья инфицировали бактериями E. carotovora и мицелием гриба S. sclerotiorum. В качестве контроля служили листья нетрансформированных растений. Фитопатоген-ными бактериями (суспензия 103—105 клеток/мл) и гриб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.