научная статья по теме НОВАЯ НИЗКОКОПИЙНАЯ ПЛАЗМИДА ЦИАНОБАКТЕРИИ ANABAENA VARIABILIS Биология

Текст научной статьи на тему «НОВАЯ НИЗКОКОПИЙНАЯ ПЛАЗМИДА ЦИАНОБАКТЕРИИ ANABAENA VARIABILIS»

= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

УДК 579.252

НОВАЯ НИЗКОКОПИЙНАЯ ПЛАЗМИДА ЦИАНОБАКТЕРИИ Anabaena variabilis

© 2013 г. А. В. Марданов1, А. В. Белецкий1, В. М. Гумеров1, Е. А. Карбышева2, Л. Е. Михеева2

Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва 117312 e-mail: mardanov@biengi.ac.ru 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики, Москва 119234

Поступила в редакцию 28.12.2012 г.

Проведено секвенирование полного генома штамма A. variabilis АТСС 29413 из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и обнаружена наряду с тремя известными плазмидами (А, В, С) ранее неизвестная кольцевая низкокопийная плазмида D. Определена полная нуклеотидная последовательность плазмиды D, составляющая 27051 пар нуклеотидов. В плазмиде выявлены гены parA и parB системы сегрегационной стабильности плазмиды, два гена, кодирующих белки репликации, ген сайт-специфической рекомбиназы, системы рестрикции-модификации типа I, а также ряд генов с неизвестными функциями. С помощью ПЦР-анализа показано, что плазмида D имеется в двух эпифитных штаммах из Вьетнама — Anabaena sp. 182 и Anabaena sp. 281, а также штаммах Anabaena sp. V5 и Anabaena azollae (Newton's isolate).

DOI: 10.7868/S0016675813080122

Цианобактерии широко используются в качестве модельных объектов для изучения фотосинтеза [1], азотфиксации [2], клеточной дифференциации [3] и процессов эволюции [4]. Нитчатые азотфиксирующие цианобактерии, к которым относится и объект настоящей работы, Anabaena variabilis, представляют практический интерес в качестве продуцентов молекулярного водорода [5-7].

Геном референсного штамма A. variabilis ATCC 29413, просеквенированный в 2005 г. в US DOE Joint Genome Institute (депонирован в Genbank под номерами NC_007413, NC_007410, NC_007411 и NC_007412), включает хромосому длиной 6365 727 пн и три кольцевые плазмиды размерами 366354 пн (плазмида А), 35762 пн (плазмида В) и 300758 пн (плазмида С). Однако в более ранних исследованиях "плазмидной фракции" ДНК аутентичного штамма A. variabilis IU1444 с помощью электрофореза в агарозном геле было выявлено наличие двух плазмид среднего размера: 25 х х 106 и 32 х 106 Da [8] или 22 х 106 и 30 х 106 Da [9]. Одна из этих плазмид, по-видимому, соответствует плазмиде B. Именно штамм Anabaena variabilis IU1444 был депонирован в American Type Culture Collection (ATCC) как A. variabilis ATCC 29413 П. Уолком, который в 1977 г. передал этот штамм в коллекцию кафедры генетики биологического факультета МГУ.

Цель настоящей работы - расшифровка и анализ нуклеотидной последовательности новой ранее неизвестной низкокопийной плазмиды D,

по-видимому утраченной в штамме, который был объектом исследования в US DOE Joint Genome Institute (США), а также поиск этой плазмиды в других штаммах рода Anabaena.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

Основным объектом данного исследования является азотфиксирующая нитчатая цианобак-терия A. variabilis ATCC 29413, геном которой полностью секвенирован (Genbank NC_007413, NC_007410, NC_007411 и NC_007412). Помимо штамма дикого типа A. variabilis, полученного от П. Уолка (США), в работе использовали также несколько штаммов цианобактерий Nostoc и Anabaena (табл. 1), в том числе природные изоляты с повышенным уровнем продукции водорода [10], и продуцирующие водород мутантные штаммы РК84 и РК17 A. variabilis ATCC 29413 [11, 12]. Все штаммы поддерживаются в коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ.

Культивирование цианобактерий

Культуры цианобактерий выращивали при 30—32°С и люминесцентном освещении с интенсивностью 40—50 мкЕ/(м-2 с-1) в жидкой среде BG11 [13]. Для культивирования цианобактерий в условиях азотфиксации использовали среду BG11q (без добавления NaNO3). Культуры выращивали в колбах Эрленмейера объемом 1 л в 400-

Таблица 1. Штаммы цианобактерий, использованные в работе

№ Штамм Год и место выделения Источник и год поступления в коллекцию каф. генетики биологического факультета МГУ Публикации

1 Anabaena variabilis ATCC 29413 (синонимы — Anabaena A-37, Anabaena flosaquae IUCC (IU) 1444, Nostoc sp. PCC 7937) 1964, пруд-отстойник, Миссисипи, США (как АпаЬаепа А-37), модельный штамм, геном секвенирован С.Р. Wolk, США, 1977 [27, 28] http://ge- nome.kazusa.or.jp/cy- anobase/AVA

2 Anabaena sp. 182 1987, Вьетнам, эпифит на листьях риса Нгуен Тхань Хьен, Вьетнам, 1988 [10]

3 Anabaena sp.281 То же То же [10]

4 Anabaena sp. V5 1988, минорный симбионт А1о11а ртпа(а И.Н. Гоготов (ИФПБ РАН, Пущино), 1988 [29, 30]

5 Anabaena azollae (Newton's isolate) 1979, минорный симбионт А1о11а еагоНтапа Коллекция каф. биоинженерии биологического факультета МГУ, 2010 [31]

6 Nostoc sp. PCC 7120/ATCC 27893 (синонимы — Anabaena sp. PCC 7120; Nostoc mus-corum ISU) 1970, Иова, США, модельный штамм, геном секвенирован С.Р. Wolk, США, 1997 [32, 33] http://ge- nome.kazusa.or.jp/cy- anobase/Anabaena

7 Nostoc punctiforme ATCC 29133/PCC 73102 Факультативный симбионт Macrozamia, модельный штамм, геном секвенирован Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН [34] http://genome.ka- zusa.or.jp/cyanobase/ NPUN

500 мл среды при перемешивании на магнитной мешалке. Скорость роста определяли по плотности суспензии спектрофотометрически при 540 нм. В данных условиях культивирования время генерации (удвоения) в логарифмической фазе роста на средах BG11 и BG11Q не превышало 20—24 ч. Длительность логарифмической фазы роста на среде BG11 составляла 9—10 дней, на среде BG11C — 14—15 дней.

Выделение препаратов геномной ДНК Anabaena variabilis ATCC29413 для пиросеквенирования

Клетки цианобактерий устойчивы к лизису при использовании стандартных методик экстрагирования ДНК из бактерий; кроме того, получаемые препараты ДНК содержат избыток белков и полисахаридов. Поэтому для выделения чистых препаратов высокомолекулярной ДНК из клеток цианобактерий использовали универсальный набор реагентов QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN), позволяющий получить препараты ДНК с фрагментами не менее 20 тпн.

Культуры штаммов дикого типа Anabaena variabilis ATCC 29413 и мутантов РК84 и РК17 выращивали с использованием магнитной мешалки в

стандартных условиях на среде BG11 в объеме 300 мл в течение 7 дней до оптической плотности OD540 ~ 2.5. Клетки собирали центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g, отмывали от среды роста буфером 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, и замораживали при —20°С. Препараты геномной ДНК выделяли, используя протокол "QIAamp DNA Stool Mini Kit". Концентрацию ДНК определяли с помощью установки NanoDrop (ND 1000, PEQLAB). Все выделенные препараты ДНК характеризовались высокой молекулярной массой и незначительным содержанием белковых примесей (OD260/OD280 > 2.05—2.1).

Пиросеквенирование и анализ нуклеотидных последовательностей

Для определения нуклеотидных последовательностей геномов Anabaena variabilis ATCC 29413 и полученных на его основе мутантов РК17 и РК84 создавали библиотеки случайных фрагментов геномной ДНК и проводили их пиросеквенирование на геномном анализаторе GS FLX с использованием набора реактивов GS XLR70 Sequencing Kit. Объем секвенирования составил 119—135 млн. пн для каждого образца, что соответствует примерно 15-20-кратному перекрытию генома.

Сборку последовательностей отдельных чтений в объединяющие их протяженные "контиги" осуществляли с помощью программы GS De Novo Assembler (Roche). Поиск открытых рамок считывания, способных кодировать белки, осуществляли с помощью программы Glimmer [14]. Для предсказания функций белков соответствующие аминокислотные последовательности сравнивали с базой данных NCBI с помощью программы BLASTP.

ПЦР-анализ геномной ДНК

Для проведения экспериментов по ПЦР-ам-плификации специфических фрагментов плаз-миды или хромосомы геномную ДНК из клеток различных штаммов цианобактерий выделяли после разрушения клеток с помощью стеклянных шариков в присутствии додецилсульфата натрия и хлороформа [15]. Клетки, собранные из 50—100 мл культуры, ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, + 10 мМ ЭДТА и интенсивно встряхивали на вортексе с добавлением равного объема хлороформа и 0.5%-ного додецилсульфата натрия. ДНК осаждали 96%-ным этанолом (2.5 объема) в течение нескольких часов при —20°С.

ПЦР-амплификацию проводили по стандартной методике в объеме 25 мкл с наслоением минерального масла на амплификаторе "Терцик" (ДНКТехнология). Реакционная смесь, приготовленная на основе набора PCR Master Mix (Fermentas), содержала 1 единицу Taq-полимеразы, 2 мМ MgCl2, по 0.2 мМ дезоксинуклеотидов, 10 нг матричной ДНК, 2 пмоля праймеров. Амплификацию проводили по следующей процедуре: начальная денатурация 94°С — 2 мин, 30 циклов 94°С - 60 с, t° отжига праймера - 60 с, 72°С -2 мин; завершающий синтез 72°С — 10 мин. Подбор праймеров проводили с помощью программы Oligo на основе нуклеотидной последовательности генома A. variabilis ATCC 29413. ПЦР-анализ геномной ДНК проводили не менее чем в трех независимых экспериментах для каждого из штаммов.

Выделение плазмид из Anabaena variabilis ATCC 29413

Для выделения "плазмидной фракции" ДНК использовали 500 мл культуры в стационарной фазе роста (14 суток), выращенной на среде Bg11. Применялись два метода: 1) метод мягкого лизиса клеток с помощью лизоцима и детергента в сахарозном буфере c последующим осаждением хромосомной ДНК 1 М NaCl во льду в течение ночи [8, 9, 16]; 2) выделение с помощью набора реагентов QlAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) с использованием двойного объема буферов, элюции с колонок двойным объемом теплого (65°С) элю-ента и последующего переосаждения этанолом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение и анализ нуклеотидной последовательности новой плазмиды

Пиросеквенирование образцов геномной ДНК лабораторного штамма дикого типа A. variabilis ATCC 29413 из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ и полученных на его основе мутантов РК17 и РК84 выявило в составе всех трех геномов неизвестную ранее кольцевую плазмиду размером 27051 пн, не представленную в референсной полногеномной последовательности A. variabilis ATCC 29413 в банке данных Genba

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»