ш
УДК 575.224
НОВАЯ СИСТЕМА ДНК-ДИАГНОСТИКИ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ СУР21 ЧЕЛОВЕКА, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВРОЖДЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ
КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ
© 2010 г. А. П. Баранник*#, А. А. Колтунова2*, Л. А. Озолиня2*, Н. В. Лаврова3*, И. А. Шилов3*, И. И. Гузов4*, Л. И. Патрушев*
*Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;
2*Российский государственный медицинский университет, Москва; 3*Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи" РАМН, Москва;
4*Центр иммунологии и репродукции, Москва Поступила в редакцию 07.10.2009 г. Принята к печати 08.11.2009 г.
Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН), тяжелое заболевание с аутосомным рецессивным наследованием относится к одному из наиболее распространенных генетических нарушений у человека. В основе ВГКН лежит недостаток или отсутствие биосинтеза ключевых стероидных гормонов кортизола и альдостерона при одновременном избыточном синтезе андрогенов в организме пациентов. Более 90% всех случаев этого заболевания являются следствием дефицита фермента 21-гидроксилазы (Р450с21). Тяжесть клинических проявлений ВГКН (от потенциально летальных тяжелых симптомов до симптомов средней и слабой тяжести) зависит от степени повреждения фермента. Основной причиной низкой активности 21-гидроксилазы являются различные мутационные повреждения гена, кодирующего данный фермент. Наличие рядом с функциональным геном СУР21, кодирующим Р450с21, высокогомологичной последовательности псевдогена затрудняет ДНК-диагностику ВГКН. Для выявления в гене СУР21 наиболее часто встречающихся точечных мутаций, ассоциированных с ВГКН, нами разработана новая система ДНК-диагностики, основанная на ПЦР в режиме реального времени, в которой использованы новые аллель-специфичные праймеры и зонды ТадМап для каждой из восьми наиболее часто встречающихся мутаций. Метод был протестирован сначала на искусственных матрицах, в которые с помощью направленного мутагенеза были введены анализируемые мутации, и затем апробирован на клиническом материале — ДНК 43 пациентов с клиническими и биохимическими проявлениями гиперандрогении. Обнаружены две мутации у двух разных индивидуумов: нонсенс-мутация Q318X и миссенс-мутация У28Ш.
Ключевые слова: врожденная гиперплазия коры надпочечников; 21-гидроксилаза; СУР21;мутации; ПЦР в режиме реального времени.
ВВЕДЕНИЕ
Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН; англ. CAH — Congenital Adrenal Hyperplasia)
(OMIM* +201910) — тяжелое наследственное заболевание, вызванное нарушением биосинтеза ключевых стероидных гормонов — кортизола и альдо-стерона. ВГКН является одним из наиболее часто встречающихся генетических нарушений у человека с аутосомно-рецессивным наследованием. Более 90% всех случаев этого заболевания вызваны умень-
Сокращения: ВГКН — врожденная гиперплазия коры надпочечников; КФ и НФ — классическая и неклассическая формы ВГКН; ГКГС — главный комплекс гистосовместимости.
#Автор для связи (тел./факс: (495) 429-86-10; эл. почта: abarannik@mx.ibch.ru).
* Online Mendelian Inheritance in Man, http//www.nc-bi.nlm.nih.gov/omim/
шением активности фермента стероид-21-гидрок-силазы (Р450с21) (КФ 1.14.99.10), который превращает прогестерон в 11-дезоксикортикостерон и 17-ОН-прогестерон в 11-дезоксикортизол. В результате энзиматического блока на уровне 21-гид-роксилазы нарушается биосинтез кортизола и альдостерона из холестерина в коре надпочечников
[1 -4].
ВГКН имеет разнообразные клинические проявления, характер которых зависит от степени нарушения активности фермента. Все множество проявлений признаков дефицита 21-гидроксила-зы в настоящее время разделяют на 2 группы: классическую, тяжелую форму заболевания (КФ), и неклассическую, более легкую (НФ) [2, 5]. КФ характеризуется практически полным отсутствием активности 21-гидроксилазы, а следовательно,
прекращением синтеза кортизола. При этом имеет место чрезмерное образование и секреция андро-генов, и почти 100%-ная вирилизация разной степени тяжести у новорожденных девочек, которая в отсутствие лечения усугубляется с возрастом (простая вирилизующая форма). У 75% больных КФ, кроме того, из-за отсутствия и кортизола и альдо-стерона нарушается баланс ионов натрия в организме, вследствие чего развивается опасный для жизни кризис уже в первые недели жизни (сольте-ряющая форма) [6, 7]. Классическая форма ВГКН обычно легко диагностируется, так как ее симптомы ярко выражены и проявляются при рождении ребенка.
Причиной неклассической формы заболевания является частичная недостаточность ферментативной активности 21-гидроксилазы. Клинические проявления многообразны и могут возникать в разном возрасте и в разных сочетаниях. Основными симптомами этой формы являются преждевременное половое созревание у обоих полов, стремительный, скачкообразный рост в подростковом периоде, гирсутизм, олигоменорея, бесплодие. Из-за стертости и разнообразия фенотипических проявлений диагностика неклассической формы ВГКН вызывает определенные трудности [8, 9].
Частота встречаемости КФ сильно варьирует и в большинстве этнических популяций находится в пределах от 1 : 12000 до 1 : 23000 новорожденных. Максимум (1 : 282) отмечен для эскимосов Аляски, а минимум (1 : 43000) — для этносов из азиатских стран. Среднее значение в мире по результатам всеобщего неонатального скрининга оценивается как 1: 15 000 [10—12]. Для европеоидной расы среднее значение встречаемости НФ составляет 1 : 100— 1 : 500. Однако у некоторых групп этот показатель намного выше и достигает 1 : 27 в популяции евреев Ашкенази, 1 : 53 — у испанцев, 1 : 63 — у бывших югославов, 1 : 333 — у итальянцев [13—16]. По усредненным оценкам гетерозиготы, несущие мутант-ный аллель, встречаются с частотой 1 : 60 [12, 17].
Основной причиной потери активности 21-гид-роксилазы являются мутационные повреждения разной степени тяжести в гене CYP21, кодирующем этот фермент. Ген CYP21 вместе с псевдогеном CYP21P расположен на коротком плече хромосомы 6 в локусе 6р21.3 в области главного комплекса ги-стосовместимости (ГКГС; англ. MHC — Major Histocompatibility Complex) III класса. Оба гена состоят из 10 экзонов. Последовательности CYP21 и CYP21P гомологичны на 98 и 96% в экзонах и интронах соответственно [18, 19].
У большинства людей европеоидной расы данный локус хромосомы 6 представляет собой тандем высокогомологичных нуклеотидных последовательностей, названных RCCX-модулями (рис. 1а).
Значительно реже встречаются трех- и даже четы-рехмодульные структуры [20—24]. Каждый КССХ-модуль включает следующие гены: ЯР1, кодирующий серин-треониновую ядерную протеинкиназу, или его укороченный нефункциональный аналог — ЯР2; ген С4, кодирующий С4-белок комплемента, который может быть представлен двумя вариантами — С4А и С4В; ген СУР21 или его псевдоген СУР21Р; ген ТИХВ, кодирующий белок внеклеточного матрикса тенасцин, или его нефункциональный аналог ТИХЛ. В типичном случае, когда модули образуют тандем, в одном из них находится функциональный ген СУР21, а в другом — его псевдоген. Такая чрезвычайно высокая гомология между повторяющимися модулями приводит к частым ошибкам при конъюгации хромосом в мейозе, что является причиной генных конверсий и неравных кроссинговеров между функциональными генами и их нефункциональными псевдогенами [25—27].
Ген СУР21 — один из самых полиморфных в геноме человека [28]. В настоящее время в гене СУР21 известно более 100 мутаций, связанных с разными формами ВГКН [29]. Из них наиболее часто встречаются 9 точечных мутаций, происходящих из псевдогена по механизму генной конверсии, а также де-леции размером 26—32 т.п.о., приводящие либо к полной потере гена СУР21, либо к образованию химерной нефункциональной СУР21Р/СУР21-после-довательности. Именно эти нарушения в 90—95% случаях являются причиной заболевания [6, 19, 30, 31]. В табл. 1 перечислены мутации, наиболее часто встречающиеся в гене СУР21, а также указана ассоциация с разными формами ВГКН.
Высокая генетическая изменчивость гена СУР21 затрудняет ДНК-диагностику ВГКН и проведение адекватного лечения. В настоящее время для обнаружения повреждающих точечных мутаций в гене СУР21 используется несколько основных подходов: аллель-специфичная гибридизация олигонуклео-тидов [33]; ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестриктазных фрагментов ДНК [34]; исследование конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК [35]; ми-ни-секвенирование [36, 37]. Все эти методы, однако, имеют ряд недостатков, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также высокую трудоемкость и, как следствие, возникновение проблемы клинического диагностирования. Решение могло бы быть достигнуто с помощью прямого секвенирования интересующей последовательности, но этот метод пока слишком дорог для практического использования в медицинской диагностике. В этой ситуации приемлемый компромисс представляет генотипирование, основанное на использовании ПЦР в режиме реального времени. В настоящее время этот метод яв-
(а)
Теломера
Область ГКГС класс III хромосомы 6
Центромера
RCCX-модуль
5'
КР1
С4А
RCCX-модуль
СУР-йе№
С4В СУР21 ТЫХЕ
СУР-ёеЯ
Делеция — 30 т.п.о. -
\ Tena32F
(б)
P30L
G110 Сдвиг рамки
1п2
U1-F
A/C > G
I172N
Кластер I236N У237Е М239К
У281L
R356W 0318Х
ех 1 ех 2 ех 3 ех ех ех ех 7 ех 8 ех 9 ех 10 \
4 5 6
F3-R
Рис. 1. Схема локуса хромосомы 6р21.3 области ГКГС III класса человека. Показана его двухмодульная структура с возможной делецией ~30 т.п.о. (а) и экзон-интронная структура входящего в него гена СУР21 (б). RP1 — ген, кодирующий серин-треониновую ядерную протеинкиназу и RP2 — его укороченный вариант; С4А и С4В — гены, кодирующие четвертый компонент комплемента; СУР21 — ген, кодирующий 21-гидроксилазу, и СУР21Р — его псевдоген; ТЫХВ — ген тенасцина и ТЫХА — его укороченный вариант. Черными прямоугольниками обозначены нефункциональные гены, белыми — функциона
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.