МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 4, с. 624-633
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 577.2:616.006
НОВЫЕ МАРКЕРЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2007 г. Е. Б. Кузнецова1' 2, Т. В. Кекеева1' 2, С. С. Ларин3, В. В. Землякова1' 2, О. В. Бабенко1' 2, М. В. Немцова1' 2, Д. В. Залетаев1, 2, В. В. Стрельников1, 2*
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 2Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации, Москва, 119992 3Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 119334 Поступила в редакцию 23.08.2006 г.
Принята к печати 30.10.2006 г.
Оптимизирован один из методов поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геномах опухолевых клеток - метилчувсгвительный фингерпринтинг. При использовании этого метода обнаружено 7 генов - SEMA6B, B1N1, VCP1P1, LAMC3, KCNH2, CACNG4 и PSMF1, подвергающихся аномальной эпигенетической регуляции при раке молочной железы (РМЖ). Определены частоты метилирования промоторных областей для каждого из выявленных генов и степень уменьшения экспрессии на материале ста парных (опухоль/морфологически неизмененный контроль) образцов ткани молочной железы. Значимые частоты аномального метилирования показаны для генов SEMA6B, B1N1 и LAMC3 (38%, 18% и 8% соответственно). В ДНК из морфологически неизмененных тканей молочной железы метилирования указанных генов не наблюдается. Методом ПЦР в реальном времени показано уменьшение экспрессии генов SEMA6B, B1N1, VCP1P1, LAMC3, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в раковых тканях с частотами от 44% до 94%. Функциональные изменения в генах SEMA6B и LAMC3 выражены в наибольшей степени, что позволяет рекомендовать включение этих генов в панели диагностических маркеров канцерогенеза при РМЖ. Проведено тонкое картирование метилирования CpG-островков генов с наиболее высокими частотами метилирования (SEMA6B, B1N1, LAMC3), что создает фундаментальную базу для разработки эффективных тест-систем анализа метилирования указанных генов.
Ключевые слова: эпигенетическая регуляция экспрессии генов, рак молочной железы, метилчув-ствительный фингерпринтинг, молекулярные маркеры метилирования и экспрессии генов.
NOVEL METHYLATION AND EXPRESSION MARKERS ASSOCIATED WITH BREAST CANCER, by E. B. Kuznetsova1,2, T. V. Kekeeva1,2, S. S. Larin3, V. V. Zemlyakova1,2, O. V. Babenko1,2, M. V. Nemtsova1,2, D. V. Zaletayev1,2, V. V. Strelnikov1,2* ^Research Centre for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia, *e-mail: vstrel@list.ru; 2Molecular Medicine Institute, Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow, 119992 Russia; 3Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia). We have developed a modification of methylation sensitive arbitrarily primed PCR, one of the methods of differentially methylated CpG islands in cancer cells genomes screening. Seven genes undergoing abnormal epige-netic regulation in breast cancer, SEMA6B, B1N1, VCP1P1, LAMC3, KCNH2, CACNG4 and PSMF1, have been identified by this method. Methylation and loss of expression frequencies were evaluated for each of the identified genes on 100 paired (cancer/morphologically intact control) breast tissue samples. Significant frequencies of abnormal methylation were detected for SEMA6B, B1N1, and LAMC3 (38%, 18%, and 8% correspondingly). Methylation of the above genes was not characteristic for morphologically intact breast tissues. Downregulation of SEMA6B, B1N1, VCP1P1, LAMC3, KCNH2, CACNG4 and PSMF1 in breast cancer was as frequent as 44-94% by real-time PCR expression assay. The most pronounced functional alterations were demonstrated for SEMA6B and LAMC3 genes, which allows recommending their inclusion into the panels of carcinogenesis diagnostic panels. Fine methylation mapping was performed for the genes most frequently methylated in breast cancer (SEMA6B, B1N1, LAMC3), providing a fundamental basis for the development of effective methylation tests for these genes.
Key words: epigenetic regulation of gene expression, breast cancer, methylation sensitive arbitrarily primed PCR, molecular markers of methylation and gene expression.
Принятые сокращения: РМЖ - рак молочной железы; МЧФП - метилчувсгвительный фингерпринтинг; МЧ-РДА - метил-чувствительный репрезентативно-дифференциальный анализ; МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР; МС-ПЦР - метил-специфическая ПЦР; ОТ-ПЦР - ПЦР обратных транскриптов.
*Эл. почта: vstrel@list.ru
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований среди женщин. Выделяют наследственные и спорадические формы РМЖ. Приблизительно у 15-20% пациенток, страдающих РМЖ, отмечается наследственная предрасположенность [1]. На сегодняшний день известно, что наследственные формы напрямую зависят от мутаций в генах, отвечающих за репарацию ДНК (BRCA1, BRCA2). Суммарный риск развития РМЖ у пациенток с терминальными мутациями в этих генах составляет от 30% до 80% [2]. Предполагается существование еще, по крайней мере, одного мажорного гена предрасположенности к РМЖ. Кроме того, описано несколько редких наследственных синдромов, ассоциированных с повышенным риском развития РМЖ, однако в структуре заболеваемости их доля не превышает 1% [2].
Спорадический рак возникает при накоплении целого ряда соматических мутаций в различных генах. Комплекс молекулярно-генетических изменений, которые характерны для спорадического РМЖ, включает в себя активацию некоторых семейств протоонкогенов, структурную и функциональную инактивацию генов-супрессоров и характерные делеции некоторых хромосомных районов, ассоциированных с РМЖ. В последнее время большое внимание уделяется не только структурным повреждениям генов, но и эпигенетическим нарушениям в опухолях, в частности, аномальному метилированию регуляторных областей генов, вовлеченных в канцерогенез. Известен целый ряд генов, метилирование CpG-островков которых ассоциировано с развитием РМЖ. Среди этих генов - регуляторы клеточного цикла (CDKN2A, CDKN2B, p14/ARF, RB1, циклины D1 и D2 и др.); гены, ответственные за апоптоз (TP53, CDKN1A, HOX5, MDM2, DAPK1, TWIST1, TMS1, FHIT); гены, отвечающие за инвазию и метаста-зирование опухолевых клеток (CDH1, CDH13, CTNB); гены гормон- и рецептор-опосредованной передачи сигналов (ESRl, PR, RARp), а также гены систем репарации ДНК (BRCA1) и детоксика-ции ксенобиотиков (GSTP1) [3, 4].
В практической онкогеномике вырисовываются три области, где можно использовать маркеры аномального метилирования ДНК. Во-первых, характеристика паттернов метилирования, достоверно ассоциированных с малигнизацией, в образцах биопсийного материала, протокового аспирата или в свободной ДНК из плазмы крови может использоваться для выявления опухолевого процесса как такового. Во-вторых, аномальное метилирование ряда CpG-островков может служить маркером того или иного фенотипа опухоли, прогноза течения заболевания, ответа на терапию и/или побочных эффектов лечения. В-третьих, аномальное метилирование некото-
рых локусов в морфологически неизмененных клетках ассоциировано с повышенным риском малигнизации и может служить предиктивным маркером рака.
Ключевая роль метилирования ДНК в поддержании нормального функционирования клетки и признание значимости нарушений метилирования ДНК как элемента этиопатогенеза заболеваний человека обусловливают необходимость разработки методов выявления и оценки метилирования. Скрининг дифференциального метилирования геномов - один из наиболее эффективных способов выявления новых генов, вовлеченных в канцерогенез, и разработки эффективных маркеров канцерогенеза [5]. В настоящей работе представлены результаты поиска новых генов, вовлеченных в канцерогенез, с использованием одного из методов скрининга дифференциального метилирования геномов - так называемого метилчув-ствительного фингерпринтинга (МЧФП), а также характеристика функциональных особенностей выявленных генов при РМЖ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клинический материал. Образцы тканей опухолей молочной железы получены от 100 больных РМЖ, оперированных в ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина и в Институте онкологии им. П.А. Герцена. Опухолевый материал и образцы условно нормальной ткани непосредственно после операции замораживали и хранили в жидком азоте. Гистологическая идентификация тканей проведена в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ РАМН и в отделе патоморфологии НИИ им. П.А. Герцена, где были получены серийные срезы замороженных образцов опухолевых и прилежащих нормальных тканей. Образцы крови нормальных доноров предоставлены донорским пунктом ММА им. И.М. Сеченова (54 образца).
Выделение геномной ДНК и РНК, синтез
кДНК. Геномную ДНК из тканей молочной железы и лимфоцитов периферической крови доноров выделяли стандартным методом фенол-хлороформной очистки [6]. РНК выделяли, используя метод кислофенольной экстракции с использованием набора "РИБО-золь-А" (фирма "Ампли-Сенс", Россия). Готовые образцы РНК, растворенные в РНК-элюэнте ("АмплиСенс", Россия), обрабатывали ДНКазой I ("Promega", США) в соответствии с рекомендациями производителя и хранили при температуре -70°С. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием набора "High-Capacity cDNA Archive kit" ("Applied Biosystems", США) по протоколу фирмы-производителя.
Метилчувствительный фингерпринтинг. Для
формирования пула GC-богатых фрагментов образцы ДНК подвергали поэтапному гидролизу. На первом этапе ДНК гидролизовали частощепя-щей рестриктазой RsaI ("Сибэнзим", Россия), сайт узнавания которой не содержит CG-динуклеоти-дов, с целью уменьшения размера фрагментов для дальнейшей амплификации и обогащения образцов фракцией интактных CpG-островков. Аликвоты полученных гидролизатов подвергали параллельному гидролизу чувствительным и не чувствительным к метилированию изошизомера-ми HpaII и MspI ("Сибэнзим", Россия), имеющими сайт узнавания CCGG.
В рестрикционную
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.