БИОХИМИЯ, 200?, том ?2, вып. 3, с. 346 - 35?
УДК 577.218
НОВЫЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕр53 ЧЕЛОВЕКА -РЕГУЛЯТОРЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И КАНЦЕРОГЕНЕЗА*
© 2007 г. К.Н. Кашкин12**, С.В. Хлгатян1, О.В. Гурова3, Д.В. Купраш4, С.А. Недоспасов1,4
1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-4716, электронная почта: kachkine@yandex.ru
2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 3 24-я городская клиническая больница, 103006 Москва, Страстной бул., 15/29 4 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32
Поступила в редакцию 25.10.06 После доработки 20.11.06
Отмечено, что мутации в гене-супрессореp53, который отвечает за регуляцию клеточного цикла и контроль генетической стабильности клеток, часто приводят к нарушениям этих процессов и могут способствовать развитию опухолей. Изучены мутации гена p53 в первичных опухолях толстой и прямой кишки 26 пациентов. Значащие мутации p53 найдены в 17 опухолях (65,4%). Обнаружено, что все точечные мутации затрагивали ДНК-связывающий домен p53 и были локализованы в экзонах 4—8 гена. В шести опухолях найдены мутантные изоформы p53 с измененной структурой доменов и(или) с альтернативным С-концом, образованные в результате сдвига рамки считывания или нарушения сплайсинга. Мутации Leu111Gln, Ser127Phe впервые обнаружены в колоректальных опухолях, а изоформа p53—305 со вставкой C4 в кодонах 300/301 и изоформа p53i9*, включающая в себя 44 нуклеотида З'-концевой части интрона 9, ранее не были найдены. Мутации p53 сочетались с наличием метастазов в лимфоузлах и III/IV стадией опухолей — признаками неблагоприятного прогноза при раке толстой и прямой кишки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: p53, ген-супрессор, мутации, изоформы, альтернативный сплайсинг, полиморфизм, рак толстой и прямой кишки.
Ген р53 относится к числу наиболее интенсивно изучаемых генов в молекулярной онкологии, поскольку его продукт играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, в поддержании целостности генома и в других важнейших процессах внутри клетки [1—4]. Мутации гена р53 приводят к нарушению этих процессов и способствуют выживанию клеток с нарушенным контролем деления и сохранности
Принятые сокращения: РТК — рак толстой и прямой кишки, ЭКО — эволюционно-консервативные области, ОТ-ПЦР — обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция, н. — нуклеотид, Ti — транзиция, Tv — трансверсия, TNM — классификация злокачественных опухолей Международного противоракового союза, 2002 г.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-272, 14.02.2007.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
генетической информации. Это способствует развитию опухолей, в частности рака толстой и прямой кишки у человека (РТК) [5, 6]. По разным сведениям мутантный p53 обнаруживается в 30—60% РТК [5]. Все сведения о мутациях p53 накапливаются в базах данных IARC TP53 database (http://www-p53.iarc.fr/) и UMD P53 Mutations Database (http://www.umd.be:2072/).
Большая часть мутаций p53 сосредоточена в эволюционно-консервативных областях (ЭКО) [7—9] и так называемых горячих точках, расположенных в ДНК-связывающем домене белка. Однако мутации встречаются и в других доменах p53, которые отвечают за трансактивацию, тет-рамеризацию, ядерный экспорт и другие важнейшие функции [10]. В норме p53 может существовать в виде ряда изоформ, которые образуются за счет альтернативного сплайсинга [11—13] и транскрипции с внутреннего промотора в инт-
роне 4 [12]. Изоформы р53 могут быть лишены некоторых функций мажорного белка, например ДНК-связывающей активности [12, 14]. В то же время некоторые изоформы р53 регулируют его собственную транскрипционную активность [12], а совместно с изоформами родственных белков р63 и р73 участвуют в тонкой регуляции дифференцировки и ответа на стресс [13]. Новые изоформы р53 могут образовываться и за счет мутаций, приводящих к нарушениям сплайсинга [15, 16]. В частности, мутации могут приводить к утрате С-конца молекулы р53 [17], который играет важную роль в ауторегуляции р53 и во взаимодействии изоформ р53, р63 и р73 в регуляции клеточного цикла, апоптоза и ответа на стресс [18—20], а также способен модифицировать действие точечных мутаций р53 [21].
В ряде работ показаны корреляции мутаций р53 при РТК с поздними стадиями прогрессии, метастазированием, дистальной или ректальной локализацией опухоли и неблагоприятным прогнозом [6, 22]. Есть данные о том, что опухоли с мутациями р53 хуже поддаются радио- и химиотерапии, поскольку более устойчивы к ДНК-повреждающим воздействиям [5, 22]. Несмотря на обширные исследования, клиническое значение анализа мутаций р53 остается неясным.
Мы еще раз обратились к проблеме мутаций и полиморфизма р53 при РТК. Чтобы убедиться, что мутации экспрессируются на уровне РНК, мы секвенировали кДНК р53 на протяжении экзонов 2—10, а в нескольких случаях секве-нировали интроны из геномной ДНК для определения причины мутации.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опухоли. Изучали мутации p53 в образцах опухолей 26 больных РТК европеоидной расы старше 35 лет. Препараты опухолевых тканей брали во время операции у пациентов 24-й городской клинической больницы (Москва) и Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина. Немедленно после резекции ткани погружали в RNAlater (Quiagen Inc., Valencia, CA), выдерживали при +4° в течение ночи и далее хранили при —20°. Опухоли классифицировали в соответствии с клиническими признаками и результатами гистологического анализа.
Выделение РНК и секвенирование. РНК из образцов опухолей выделяли с помощью TriReagent («Sigma», США). Качество выделенной РНК контролировали с помощью спектрофотометра и электрофореза в агарозе. Очищенную РНК хранили в 80%-ном этаноле с 0,3 М ацетатом
натрия при —80°. Обратную транскрипцию проводили на 1 мкг РНК с использованием набора Reverse Transcription System with Random Primers («Promega Corp.», США) по протоколу «Promega». кДНК p53 амплифицировали в виде четырех перекрывающихся фрагментов, захватывавших экзоны 2—10 (рис. 1). Первый фрагмент включал в себя экзоны 2 и 3 и был ампли-фицирован с помощью следующих праймеров (указаны в ориентации от конца 5' к концу 3'): прямого F1 (TGC TTT CCA CGA CGG TGA CAC) и встречного R1 (CAG TTG GCA AAA CAT CTT GTT GAG G). Второй фрагмент включал в себя экзоны 5 и 6 и был амплифицирован с помощью праймеров F2 (TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC) и R2 (GCC GCC CAT GCA GGA ACT GT). Третий фрагмент включал в себя экзоны 7—9 и был амплифицирован с помощью праймеров F3 (TGG CCC CTC CTC AGC ATC TTA) и R3 (CAA GGC CTC ATT CAG CTC TCG). Четвертый фрагмент включал в себя эк-зоны 9 и 10 и был амплифицирован с помощью праймеров F4 (CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT C) и R4 (CTG ACG CAC ACC TAT TGC AAG C). ПЦР проводили в объеме 50 мкл с использованием набора для амплификации ДНК с Taq-полимеразой фирмы «Силекс» (Россия) и амплификатора Mastercycler personal («Eppendorf», Германия) по стандартному протоколу: один этап — 95°, 2 мин, 30 циклов амплификации (95°, 30 с; 64°, 1 мин; 72°; 1 мин), и один этап — 72°, 5 мин. Продукты ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле и с помощью набора колонок для очистки ДНК фирмы «Хеликон» (Россия).
Очищенные фрагменты ДНК секвенировали с внутренних праймеров в двух направлениях. Первые фрагменты секвенировали с помощью праймеров SF1 (GAC GGT GAC ACG CTT CCC TGG AT) и SR1 (TCT TGT TGA GGG CAG GGG AGT AC), вторые - праймеров SF2 (GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG) и SR2 (CAC ATG TAG TTG TAG TGG ATG GTG GT), третьи -праймеров SF3 (ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT) и SR3 (CTC ATT CAG CTC TCG GAA CAT CTC), четвертые — праймеров SF4 (ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG) и SR4 (CCT ATT GCA AGC AAG GGT TCA AAG A).
Интрон 3 гена p53 амплифицировали с помощью праймеров i3F (GAA GCG AAA ATT CAT GGG ACT) и i3R (GAA CCA TTG TTC AAT ATC GTC) и секвенировали с помощью прайме-ров i3SF (GGG ACT GAC TTT CTG CTC TTG TCT) и i3SR (CGG GGA CAG CAT CAA ATC ATC CAT T). Интрон 4 амплифицировали в виде одного фрагмента длиной 957 пар нуклеотидов с праймерами F2 и i4R (TCA TGT GCT GTG ACT GCT TGT AGA TG). Секвенирование амплифи-
а
IV V
10
11
F1
tr
SF1
б
Н
R1
F3
SR1
SF3
F2
SF2
SR2 SF4
R3 SR3
4
SR4
i-2 ¡-3 i-4
i3F ¡3R F2 ¡4SR2 ¡R4
¡3SF <S ¡3SR => SF2 U ¡4SF ¡4SR1
(f
Рис. 1. Схема амплификации (праймеры показаны сплошными стрелками) и секвенирования (белые стрелки; не в масштабе) р53. а — Схема секвенирования кДНК р53. Экзоны обозначены арабскими цифрами, консервативные районы — римскими. б — Схема секвенирования интронов 3 и 4 (1-3, 1-4) генар53
цированного интрона 4 проводили с помощью четырех праймеров: двух прямых, SF2 и i4SF (AAG ACC AGC CTG GGT AAC ATG ATG), и двух встречных, i4SR1 (TAG ATG GCC ATG GCG CGG A) и i4SR2 (ATC ATG TTA CCC AGG CTG GTC TTG A).
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 («Applied Biosystems», США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant («Applied Biosystems»). Анализ хрома-тограмм, сборку и выравнивание последовательностей проводили с помощью программы Vector NTI v. 10 («Invitrogen Corp.», США). Последовательности, полученные в эксперименте, выравнивали с каноническими последовательностями мРНКp53 (ac. No. NM_000546) и генаp53 (ac. No. X54156) из NCBI GenBank.
Статистический анализ. Опухоли группировали по наличию и типу мутаций p53 и сопоставляли по клиническим признакам (стадии болезни I—IV, классификация TNM, размер и характер роста опухоли, гистологический уровень дифференцированности, пол и возраст пациента). Для сравнения групп использовали программу Статистика 5.5 («Statsoft Inc.», США), применяли критерий х2, а для групп числен-
ностью менее трех пациентов — односторонний тест Фишера (P}).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мы исследовали образцы опухолей 26 больных РТК европеоидной расы старше 35 лет. Эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.