БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.6, с. 1008-1013
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.353:616.12-007.61
НОВЫЕ ПЕПТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА ПОДАВЛЯЮТ ГИПЕРП Р ОНИЦАЕМОСТЬ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ
© 2010 г. А.В. Марченко, Е.О. Степанова, А.В. Секридова, М.В. Сидорова, В.Н. Бушуев, Ж.Д. Беспалова, В.П. Ширинский
ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплексМЗ и CP РФ, 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а E-mail: $Ыптку@сагйю.ги Поступила в p едакцию 29.06.10 г.
Исследована способность новых проникающих в клетки пептидных молекул, созданных на основе пептидного ингибитора киназы легких цепей миозина L-ПИК (Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys), ингибировать эту киназу in vitro и снижать тромбин-индуцированную ги-перпр оницаемость монослоя эндотелиальных клеток в культур е. Установлено, что соединения [N MeArg ]-L -ПИК и [Cit ]-L -ПИК обладают сравнимой с L-ПИК ингибитор ной активностью в отношении киназы легких цепей миозина и способностью подавлять гиперпроницаемость эндотелия, в то время как другие модификации L-ПИК демонстрируют сниженную ингиби-торную активность. Таким обр азом, среди вновь синтезированных пептидов [N MeArg ]-Ь-ПИК и [Cit ]-L-ПИК обладают ингибиторными свойствами исходного пептида L-ПИК и при этом превосходят его по устойчивости к деградации в плазме крови. Эти пептиды могут быть использованы при создании новых противоотечных средств.
Ключевые слова: пептид, ингибитор, киназа легких цепей миозина, гиперпроницаемость, эндотелий.
Развитие острого отека жизненно важных органов (легких, мозга и др.) в результате действия на организм инфекционных, токсических и других факторов требует срочного медицинского вмешательства. Однако, несмотря на достижения в медицинских технологиях, смертность от острого отека легких в России и развитых странах мира остается высокой, что связано, в частности, с недостаточным выбором эффективных противоотечных препаратов. Основными средствами для борьбы с отеком являются диуретики и кристаллоиды, т.е. вещества не воздействующие на центральное звено в развитии отека - эндотелий микрососудов. Эффективными противоотечными средствами являются глюкокортикоидные гормоны, но их собственная токсичность и побочные действия создают большие проблемы при клиническом пр именении [1]. Р азработка новых противоотечных ср едств базир уется на понимании молеку-
Сокращения: РЛЦ - регуляторные легкие цепи, EGTA -этиленгликольтетрауксусная кислота, TBS - трис-буфер-ный раствор, TBST - трис-буферный раствор, содержащий 0,1% твина 20, FBS - эмбриональная бычья сыворотка, ECGS - ростовые добавки для эндотелиальных клеток, КЛЦМ - киназа легких цепей миозина, ПИК - пептидный ингибитор киназы, ТММ - тяжелый меромиозин.
лярных механизмов поддержания барьерной функции микрососудистого эндотелия и путей ее нарушения в стрессовых ситуациях.
Монослой эндотелия расположен на границе между кровью и тканью и выполняет ряд важнейших функций. Эндотелиальные клетки регулируют тонус гладкомышечных клеток сосудистой стенки и гемодинамику, иммунные реакции, ангиогенез, гемостаз. В микросо суди-стом сегменте системы кровообращения эндотелий опосредует обмен веществ между кровью и тканями. Важным физиологическим свойством эндотелиального слоя является его избирательная проницаемость. Низкомолекулярные вещества, такие как вода, мочевина, глюкоза, газы, свободно проходят между эндотелиаль-ными клетками, т.е. парацеллюлярно. Для макромолекул межэндотелиальные контакты представляют непреодолимое препятствие, и альбумин и другие белки плазмы переносятся в ткань через тело эндотелиальных клеток, т.е. транс-целлюлярно по механизму трансцитоза [2]. Нарушение эндотелиального барьера происходит под действием множества факторов, таких как тромбин, брадикинин, гистамин, провоспали-тельные интерлейкины, фактор некроза опухоли, фактор роста эндотелия сосудов, активные
фор мы кислорода, избыточные физико -химические воздействия, в совокупности называемые эдемагенными факторами. П ри этом контакты между эндотелиальными клетками ослабляются, центростремительные внутриклеточные сокращения приводят к возникновению свободного пространства между клетками, усиливается па-рацеллюлярный транспорт веществ. Монослой эндотелия теряет селективно сть, и р азвивается богатый белком отек ткани.
Одним из ключевых регуляторов сократительной активности клеток, в том числе и эн-дотелиальных, является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). Этот фермент активируется при действии многих эдемагенных факторов и запускает сокращение эндотелия микрососудов, что приводит к нарушению его барьерной функции и развитию отека ткани. В связи с этим перспективным подходом к снижению гипер-пр оницаемости сосудов микр оцир кулярного русла в стрессовых ситуациях является подавление сократительной реакции эндотелия путем ингибирования эндотелиальной КЛЦМ. В качестве фармакологически привлекательных ингибиторов КЛЦМ в настоящее вр емя рассматриваются пептидные аналоги автоингибитор-ной последовательности КЛЦМ [3]. Первым ингибитором данного класса стал так называемый пептид 18 (Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys) или L-ПИК (пептидный ингибитор киназы), разработанный Lukas et al. [4]. ПИК проникает в клетки через плазматическую мембрану благодаря кластеру положительно заряженных аминокислот, последовательность которых напоминает первичную структуру транс-дукционного пептида белка ТАТ вируса иммунодефицита человека [5].
Существенным недостатком L-ПИК является его низкая устойчивость к деградации под действием протеолитических ферментов плазмы крови [6]. По данным 1Н-ЯМР-спектроскопии, процесс деградации L-ПИК преимущественно идет с N-конца, в то время как отщепление С-концевого аминокислотного остатка, защищенного амидной связью, замедлено. Для повышения устойчивости L-ПИК к пептидазам в его структуре был сделан ряд направленных модификаций по первому, третьему и четвертому положениям. Дополнительно было предложено использовать в биологических экспериментах энантиомер L-ПИК из D-аминокислот (D-ПИК; [6]). Известно, что D-пептиды являются более устойчивыми соединениями, чем их L-аминокислотные аналоги, так как они не распознаются протеолитическими ферментами [7]. И сследование устойчивости полученных пептидов в плазме кр ови методом ЯМР пока-
Таблица 1. Модификации L-ПИК, использованные в pаботе
Пептид Модификация
L-ПИК Не модифицирован
[N aMeArg1]-L-ПИК N aмeтилаpгинин в 1 положении
[Сй^-Ь-ПИК Цитруллин в 1 положении
[Сй^От^-Ь-ПИК Цитруллин в 1, о р нитин в 3 положении
[Val4]-L-ПИК Валин в 4 положении
D-ПИК Энантиомер L-ПИК
зало, что модификация L-ПИК в первом положении увеличила время полужизни пептида в 2,5 раза, а защита в третьем и четвертом положениях на стабильность не повлияла [8]. Как и ожидалось, D-ПИК многократно превосходил L-аминокислотные модификации ПИК по устойчивости в плазме кр ови.
В настоящей работе проведено сравнение ингибиторных свойств новых и известных модификаций ПИК in vitro и их способности подавлять тромбин-индуцированную гипер пр они-цаемость эндотелия в культуре.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали набор пептидных ингибиторов КЛЦМ на основе L-ПИК, синтезированных в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе МЗ РФ ([5,8], табл. 1). Все р еактивы общего назначения были аналитической чистоты и приобретены в фирмах «ДиаМ» (Россия), Sigma (США), Serva (Германия), Fluka (Швейцария), Bio-Rad (США). КЛЦМ выделяли из мускульных желудков кур [9]. Препарат кальмодулина был любезно предоставлен проф. Н .Б. Гусевым (Биологический факультет МГУ им. М.И. Ломоносова). Препарат регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина был любезно предоставлен проф. К. Кремо (Университет штата Невада, США). И спользо-вали также кроличьи антитела к РЛЦ (anti-MRLC-2) ^rote^te^ вгоир, 1пс. (США)), мышиные антитела к монофосфорилированной форме РЛЦ (Cell Signaling (США)), нитроцеллюлозу (МИНроге (США)), набор для ECL fierce (США)), р ентгеновскую пленку Retina («Медтехника», Россия).
Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина киназой легких цепей миозина in vitro проводили пр и температур е 30°С в р еак-ционной смеси следующего состава: 100 мМ Nad, 1 мМ дитиотреитола 1 мМ Mgd2, 0,5
мМ CaCl2, 0,3 мкМ CаМ, 5 нМ КЛЦМ, 20 мкМ РЛЦ и 10 мМ MOPS. Пептидные ингибиторы КЛЦМ использовали в концентрации 5 мкМ и ниже. Реакцию инициировали внесением в пробу раствора Mg2+-AT Ф до конечной концентрации 0,5 мМ. Пробы отбирали в течение 20 мин после начала реакции. Реакцию останавливали внесением пробы в 15 мМ раствор EGTA. Уровень фосфорилирования Р ЛЦ определяли методом дот-блот. П р обы с исследуемыми белками (2 мкл) наносили на нитро-целлюлозную мембрану в виде капли, фиксировали в течение 10 мин 0,25% глутаровым альдегидом и инкубировали в 5% р а створ е обезжиренного молока на трис-буфер ном раствор е (TBS) в течение 40 мин. Затем последовательно инкубировали мембраны с антителами мыши против монофосфорилированной формы РЛЦ в разведении 1:1200 и в течение 1 ч со вторичными антителами против IgG мыши, конъюги-рованными с пероксидазой, в р азведении 1:25000. После каждой стадии проводили отмывание мембран в трис-буфер ном р астворе, содержащем 0,1% твина 20 (TBST) три раза по 5 мин. Образовавшиеся иммунные комплексы идентифицировали методом ECL с помощью растворов фирмы Р1егсе ^ША). В предварительных экспериментах с помощью окрашивания мембран антителами к РЛЦ была подтверждена одинаковая нагрузка всех образцов по общему количеству РЛЦ. Полученное изображение на рентгеновской пленке сканировали и обсчитывали в программе ImageJ ^ША). Данные обр абатывали в пр ограмме Ехсе1 и стр оили график зависимости величины сигнала (отн. ед.) от времени реакции. Cpавнение ингибитор-ных эффектов всех производных ПИК проводили по величинам сигналов, зарегистрированных на 10-й минуте р еакции.
Определение проницаемости монослоя эндо-телиальных клеток. И спользовали культуры эн-дотелиальных клеток EA.hy926 (АТCC, CША) и BPAEC (Bovine ри1тоиагу artery endothelial се1к; Cell App1ications 1пс, CША). Для экспериментов использовали 24
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.