МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 4, с. 657-665
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.214 Ускоренная публикация
НОВЫЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ^ис-ЭЛЕМЕНТЫ В ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА ХЕМОКИНА CXCL13, НАХОДЯЩЕГОСЯ ПОД КОНТРОЛЕМ АЛЬТЕРНАТИВНОГО NF-kB-ПУТИ
© 2009 г. Л. В. Британова, Д. В. Купраш*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 24.03.2009 г. Принята к печати 27.03.2009 г.
С целью идентификации новых потенциальных, в том числе NF-KB-зависимых, регуляторных ^нс-элементов изучена проксимальная область промотора гена хемокина CXCL13. Анализ связывания факторов транскрипции in vitro и активности промотора в системе с геном-репортером выявил в нем два новых регуляторных элемента: потенциальный сайт связывания факторов семейства Rel/NF-kB, необходимый для индуцируемой экспрессии гена, и впервые охарактеризованный в промоторе гена-мишени альтернативного NF-kB-пути сайт связывания фактора Sp1, критичный для базовой транскрипции. Эти наблюдения помогут в изучении механизмов и сигнальных каскадов, регулирующих экспрессию генов, находящихся под контролем альтернативного NF-kB-пути.
Ключевые слова: транскрипция, ДНК-связывающие белки, иммунная система.
NEW PUTATIVE CONTROL ELEMENTS IN THE PROMOTER OF CXCL13 CHEMOKINE GENE, A TARGET OF ALTERNATIVE NF-kB PATHWAY, by L. V. Britanova, D. V. Kuprash* (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 119991 Moscow, Russia; *e-mail: ku-prash@eimb.ru). We searched the proximal promoter region of CXCL13/BLC chemokine gene for new putative control elements, including potential NF-kB binding sites. Using electrophoretic mobility shift assay and reporter gene analysis we identified two new promoter elements. The first element contains Rel/NF-kB binding site and seems to participate in inducible gene expression, while another site binds transcription factor Sp1 and is critical for basic transcription. It is the first indication that alternative NF-kB pathway target genes are probably cooperatively controlled by factors Rel/NF-kB and Sp1. Identification of a functional Sp1 site in the promoter of a target gene of alternative NF-kB pathway will be useful for investigation of molecular mechanisms and signal pathways involved.
Keywords: transcription, DNA-binding proteins, immune system.
Белки группы Rel/NF-кB представляют собой эволюционно стабильный модуль, участвующий в регуляции множества физиологических реакций и, в частности, в иммунном ответе. Система Rel/NF-кB описана в целом ряде обзорных работ с акцентом на механизмы передачи сигнала [1], биологические функции [2, 3] и животные модели [4, 5]. У млекопитающих семейство факторов транскрипции Rel/NF-кB кодируется пятью генами: Яв1А ф65), ЯвШ, с-Яв1, ИЕ-кБ1 (кодирует p50 и его предшественник p105) и ИЕ-кБ2 (кодирует p52 и его предшественник p100). Комплексную роль факторов Rel/NF-кB в иммунитете часто описывают в рамках двух сигнальных путей, так называемых классического и альтернативного, в которые вовлечены ди-
*
Эл. почта: kuprash@eimb.ru
меры Rel/NF-KB разного субъединичного состава, активирующие различные наборы генов [6].
Известные к настоящему времени рецепторы, которые активируют альтернативный NF-kB-путь и определяют его роль в адаптивном иммунитете, принадлежат к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR) [7]. Показано, что ли-ганды к LTPR, CD40, BAFFR и RANK способны активировать также классический сигнальный каскад NF-KB. Однако именно альтернативный NF-KB-путь в первую очередь отвечает за развитие и поддержание структуры лимфоидных органов и оптимальный адаптивный иммунный ответ. Активация этого пути ведет к транспорту в ядро транскрипционно активного комплекса RelB/p52, который регулирует продукцию хемокинов SLC, ELC, SDF-1, BLC и дру-
гих белков, вовлеченных в лимфоорганогенез, например, GlyCAM-1 и PNAd [8].
Специфичность действия факторов семейства Rel/NF-кB определяется на нескольких уровнях. Это временной контроль генной экспрессии, структура хроматина в клетках соответствующего статуса, ковалентные модификации факторов транскрипции, возможность взаимодействия с кофакторами и нуклеотидная последовательность в сайтах узнавания [9]. Для каждого из этих случаев известны примеры дискриминации в привлечении диме-ров Rel/NF-кB различного субъединичного состава и в активации различных генов, однако, что именно определяет специфичность действия альтернативного ^-^-пути в отличие от классического, остается слабо изученным.
Ген хемокина BLC (B-lymphocyte chemoattractant, или CXCL13 по стандартной номенклатуре) описан как мишень альтернативного ^-^-пути, и использован нами в качестве модели активации транскрипции этим сигнальным каскадом на уровне взаимодействия цмс-элементов с факторами транскрипции. BLC/CXCL13 участвует в хоуминге В-клеток во вторичные лимфоидные органы. CXCL13 и его рецептор CXCR5 необходимы для полноценного формирования периферических лимфатических узлов, Пейеровых бляшек и нормальной микроархитектуры селезенки [10-13]. Мыши с нокаутом гена схс113 имеют фенотип, частично воспроизводящий фенотип мышей с дефицитом других компонентов оси LTPR-NIK-IKKa-RelB/p52, т.е. данные генетических исследований указывают на ключевую роль альтернативного NF-кB-пути [14-16].
Регуляция экспрессии гена СХСЬ13 через альтернативный №-^-путь изучена ранее [17]. Методом иммунопреципитации хроматина показано, что RelB-содержащие димеры поступают к проксимальной области промотора в ответ на стимуляцию LTPR. Однако потенциальный сайт связывания, картированный с применением укороченных ре-комбинантных белков, синтезированных в бактериях, не связывал нативные белки [18]. Поэтому мы продолжили поиск в проксимальной области промотора гена схс113 дополнительных регуляторных цмс-элементов, содержащих сайты связывания как известных регуляторов экспрессии гена, так и других факторов транскрипции, что будет указывать на существование других возможных путей передачи сигнала.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные культуры, трансфекция и получение суммарных лизатов. Использовали культуры клеток 293 HEK, которые культивировали по стандартной методике в среде DMEM, дополненной 10%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота, незаменимыми аминокислотами, глу-
тамином и антибиотиками (пенициллин/стрептомицин) ("HyClone").
Клетки трансфицировали кальций-фосфатным методом с использованием ProFectionR Mammalian Transfection Systems фирмы "Promega", согласно протоколу изготовителя.
Плазмиды, кодирующие факторы NF-^, и оптимальные условия котрансфекции описаны в [18].
Лизте клеток. К осадку клеток в соотношении 5 : 1 добавляли лизирующий буфер, содержащий NaCl 250 мЫ, HEPES, pH 7.5-8.0 10 мЫ, Tpитoн X-100 0.1%, EDTA 1 мУ, EGTA 1 мУ, DTT 1 мУ, PMSF 0.5 iuM, Protease Inhibitor Cocktail ("Sigma", "Roche" или "Calbiochem"). После инкубации в течение 15 мин на льду с пипетированием каждые несколько минут лизат осветляли центрифугированием в течение 15 с (13200 об/мин, настольная центрифуга Eppendorf 5415D).
Получение стромы селезенки мышей дикого типа (линия C57Bl/6). Селезенки мышей измельчали и протирали через пластиковое сито с ячейками размером 70 мкм ("Falcon BD") для удаления большей части клеток гемопоэтического ряда. Таким образом обеспечивали обогащение фракции клетками стромы селезенки. Не прошедшие через сито клетки и волокнистые образования использовали для приготовления лизатов.
Задержка ДНК в нуклeoпpoтeинoвoм геле. Связывание ДНК-пробы с белками клеточного ли-зата проводили в реакционной смеси, содержащей 12 мM HEPES, pH 7.5, 1 мM EDTA, 1 мM EGTA, 12% глицерина, 1 мкг обработанной ультразвуком двухцепочечной ДНК из молок лосося, от S до 80 фмоль меченной 32P, очищенной гель-фильтрацией пробы и 4 мкл клеточного лизата, в суммарном объеме 10 мкл. После инкубации в течение 30 мин при 40C 7 мкл реакционной смеси наносили на неденатурирующий 5%-ный полиакриламидный гель. Электрофорез проводили при 4°C в 0.5x буфере Трис-борат-EDTA (0.5 xTBE). B случае анализа связывания специфических антител с ДНК-белковыми комплексами реакционные смеси перед нанесением на гель инкубировали с антителами (0.7-1 мкл на реакцию связывания) при 4°C в течение 15-30 мин. Антитела к факторам RelA, RelB и Sp-1 приобретены у фирмы "Santa Cruz Biotechnology" (sc-372X, sc-226X и sc-59X).
Короткие пробы для задержки ДНК в нук-леопротеиновом геле метили фрагментом Кленова в присутствии [a-32P]dATP и очищали гель-фильтрацией на одноразовых колонках ("Amersham").
Короткие двухцепочечные пробы с липкими концами получены попарным отжигом одноцепо-чечных олигонуклеотидов. M-CSF-^: 5'-AGC TCA GAG GGG ACT TTC CGA GAG, 5'-AGC TCT CTC GGA AAG TCC CCT CTG; anti-^: 5'-AGC TCA GAC TCG ACT TTC CGA GAG, 5'-AGC TCT CTC GGA AAG TCG AGT CTG; m3: 5'-AGC TGA GCT GGG
AAT GCA CGC ACA, 5'-AGC TTG TGC GTG CAT TCC CAG CTC; h4: 5'-AGC TGC AGT GGG AGG GCC CTT ACT, 5'-AGC TAG TAA GGG CCC TCC CAC TGC; sp-1: 54-CAT TCG ATC GGG GCG GGG CG, 54-GCT CGC CCC GCC CCG ATC G; Mut4: 5'-AGC TTC AGT TCG ACT TTC CTG GCT, 5'-AGC TAG CCA GGA AAG TCG AAC TGA.
Длинные (более 3G п.н.) пробы получены с помощью стандартной реакции Ê^P на геномной ДНК мыши дикого типа в присутствии [a-32P]dATP с использованием следующих олигонуклеотидных прай-меров: FWG5 - 5'-AGT GAC ACA GGT ACA CCA AG; Rv05 - 5'-TTG TCA GAC ACT CCT TCA C; FWG55 - 5'-TAT GTG AAG GAG TGT CTG AC; RVG55 - 5'-GCT TAC GTT AAG CCA CAG TG; FW06 - 5'-TCA CTG TGG CTT AAC GTA AG; RvG6 - 5'-CTA AGG TAC TCT TTA GGA GTG; FW065 - 5'-TAG GTG GGT AAT GGC CAG TG; RV065 - 5'-GGA TGC TGT GGA GAT TTG AG; FWG7 - 5'-CTC AAA TCT CCA CAG CAT CC; RVG7 - 5'-GCT TGC CTT TAC AGA AGA AG; FW075 - 5'-GCA AGA CGA ATT TCT TCT TCT G; RVG75 - 5'-GAG AAG CAG CGT TGC TGT G; FW08 -5'-AGC TAA AGG TTG AAC TCC AC; Rv08 - 5'-AGT TAA GAC TGC CTT CCC AG; FWG75-1 - 5'-GCA AGC TCA GCA ATA TTT TGG; RVG75-1 - 5'-CTT AGG TCA GCT GCA ATG TC; FWG75-2 - 5'-GAC CTA AGA AAG AGA GGG TC; RVG75-2 - 5'-GAC TCC TAT TTA TTT ATA CCA GC; FW075-3 - 5'-TAA ATA GG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.