ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 3, с. 318-323
УДК 582.282.123.2.57.063.7:547.94
НОВЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ -
ГРИБЫ РОДА Pénicillium, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВЕЧНОЙ МЕРЗЛОТЫ
© 2011 г. Т. В. Антипова, В. П. Желифонова, Б. П. Баскунов, С. М. Озерская,
Н. Е. Иванушкина, А. Г. Козловский
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 e-mail: kozlovski@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 24.05.2010 г.
Проведен скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди 25 штаммов грибов рода Pénicillium, выделенных из отложений вечной мерзлоты Арктики, Антарктиды и из мерзлого вулканического пепла Камчатки. Обнаружено, что половина из исследованных штаммов синтезирует биологически активные вещества алкалоидной природы: эргоалкалоиды, дикетопиперазины и производные хи-нолина. Большая часть из идентифицированных метаболитов относится к микотоксинам. Найден штамм Pénicillium waksmanii — продуцент эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов, исследованы его основные физиолого-биохимические характеристики.
Поиск новых продуцентов неизвестных биологически активных веществ и практически важных метаболитов не перестает привлекать внимание биотехнологов различных направлений, а также научных работников, занимающихся фундаментальными аспектами микробиологии. О важности проблемы свидетельствует тот факт, что природные соединения и полученные на их основе полусинтетические вещества представляют собой более половины из используемых в практике лекарственных средств [1]. Биосинтетический потенциал микроорганизмов, особенно грибов, далеко не исчерпан, в настоящее время изучено не более 10% их метаболического разнообразия. В последние годы поиск новых продуцентов биологически активных соединений ведется среди микроорганизмов, выделенных из экзотических и практически неизученных местообитаний. Такой подход позволяет с большей вероятностью ожидать обнаружения продуцентов не только уже известных, но и новых для науки биоактивных веществ.
Грибы рода РвтеШшт хорошо известны как продуценты различных вторичных метаболитов, обладающих ценными фармацевтическими и терапевтическими свойствами. Среди разнообразных соединений, синтезируемых пенициллами, особый интерес представляет большая группа биологически активных веществ, таких как эргоалкалоиды, дикетопиперазиновые и хинолиновые алкалоиды.
Цель работы — поиск новых продуцентов вторичных метаболитов среди штаммов грибов рода РвтеШшт, выделенных из грунтов вечной мерзлоты
Арктики, Антарктиды, мерзлых пеплов Камчатки и изучение их физиолого-биохимических характеристик.
МЕТОДИКА
Объектами исследования были 25 штаммов грибов рода Penicillium, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН. Штаммы были выделены из арктических многолет-немерзлых грунтов Колымской низменности — P canescens Sopp ВКМ FW-2648, ВКМ FW-2836, P chrysogenum Thom ВКМ FW-2739, ВКМ FW-2835, ВКМ FW-2873, Р. citrinum Thom ВКМ FW-2621, ВКМ FW-2629, ВКМ FW-2631; Р. commune Thom ВКМ FW-2829, ВКМ FW-2830; P. fellutanum Biourge ВКМ FW-2611; P. simplicissimum (Oudem.) Thom ВКМ FW-2435, ВКМ FW-2461, ВКМ FW-2735; P waksmanii К. М. Zalessky ВКМ FW-2866, ВКМ FW-2875; из многолетнемерзлых грунтов Антарктиды - Р. chrysogenum ВКМ FW-2877, Р. citrinum ВКМ FW-2882, Р. commune ВКМ FW-2885, P corylophilum Dierckx ВКМ FW-1455, P jensenii К. М. Zalessky ВКМ FW-2903, из воды озера Радек в Антарктидe — P. janczewskii К. М. Zalessky ВКМ FW-2919, P waksmanii ВКМ FW-2936, а также из мерзлого вулканического пепла Камчатки — Р. chrysogenum ВКМ FW-2863, Р. commune ВКМ FW-2666 [2].
Идентификацию штаммов проводили по макро-и микроморфологическим признакам у 7-суточных культур, выращенных при 5, 25 и 37°С на агаризо-ванных средах CYA—среда Чапека с дрожжевым ав-толизатом, MEA — мальц-экстракт агар и G25N — нитратный агар, содержащий 25% глицерина [3].
При изучении продукции вторичных метаболитов грибы культивировали глубинным способом на среде Абе следующего состава (г/л дистиллированной воды): маннит — 50.0; янтарная кислота — 5.4; MgSO4 • 7H2O - 0.3; KH2PO4 - 1.0; рН доводили до 5.4 25%-ным раствором NH4OH. Грибы выращивали в 150 мл среды в колбах объемом 750 мл при 24 ± 1°С на качалке (220 об/мин). Засев среды осуществляли водной суспензией конидий (1-2 х х 107 спор/мл) 14-суточных культур, выращенных на скошенном сусло-агаре. Отбор проб проводили на 7 и 14 сут.
Внеклеточные метаболиты кислой, нейтральной и щелочной природы извлекали из фильтрата куль-туральной жидкости трехкратной экстракцией хлороформом по ранее описанной методике [4]. Анализ экстрактов осуществляли методом ТСХ на пластинках силикагеля (Silica gel F254, "Merck", Германия) в системах I и II: хлороформ-метанол-25%-ный NH4OH 90 : 10 : 0.1 (I) и 80 : 20 : 0.2 (II). Вещества обнаруживали по поглощению и флуоресценции в УФ-свете и после опрыскивания пластин реактивами Драгендорфа для обнаружения азотсодержащих метаболитов и Эрлиха для обнаружения индольных алкалоидов.
Выделение и очистку метаболитов проводили препаративной ТСХ на пластинах силикагеля. Идентификацию метаболитов осуществляли со-хроматографией со стандартными образцами, полученными ранее в лаборатории вторичных метаболитов ИБФМ РАН, а также с использованием физико-химических методов. УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160 А, фирмы "Shimadzu" (Япония). Масс-спектры соединений регистрировали на масс-спектрометре LCQ Advantage MAX "Thermo Finnigan" (Германия), используя одноканальный шприцевой насос для прямого ввода образца в область химической ионизации при атмосферном давлении. Сбор и обработку масс-спектрометрических данных осуществляли с помощью программного обеспечения Xcalibur. Детекцию метаболитов для более полной информации проводили как в положительных, так и в отрицательных ионах. МС/МС спектры получали при нормализованной энергии столкновений 20-40%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация вторичных метаболитов. Изучение продукции вторичных метаболитов грибами, выделенными из регионов вечной мерзлоты, показало, что почти половина из изученных культур способна синтезировать азотсодержащие низкомолекулярные соединения разнообразных структур. Биосинтеза поликетидных метаболитов - патули-на, гризеофульвина, пеницилловой кислоты, охра-токсинов и PR-токсина у изученных штаммов об-
наружено не было. По спектру продуцируемых вторичных метаболитов штаммы можно разделить на три группы. К первой группе были отнесены штаммы Р. commune ВКМ FW-2885, FW-2829, FW-2666, FW-2830, синтезирующие метаболит 1 с R = 0.25 (I), дающий с реактивом Эрлиха фиолетовое окрашивание, которое указывает на наличие индольной структуры в данном соединении. УФ-спектр выделенного метаболита был типичен для клавиновых эргоалкалоидов с характерным для а-циклопиазо-новой кислоты (ЦПК) плечом в области 250 нм [5]. Молекулярная масса метаболита 1 (336 Да) и его масс-спектр совпадал со стандартным образцом ЦПК (табл. 1). ТСХ со стандартными образцами также показала одинаковую хроматографическую подвижность метаболита 1 на пластинах силикагеля в системах (I, II) с заведомым образцом ЦПК. Таким образом, на основании физико-химических характеристик выделенного метаболита, которые практически совпали с литературными данными [5], и прямого сравнения со стандартным образцом данное соединение было идентифицировано как клавиновый эргоалкалоид ЦПК.
У второй группы штаммов P. chrysogenum ВКМ FW-2863, FW-2739, FW-2873, FW-2877, FW-2835 обнаружен метаболит 2 с R = 0.2 (I), дающий с реактивом Эрлиха сначала желтое, а со временем голубое окрашивание. Аналогичная окраска с этим реактивом характерна для дикетопиперазинового алкалоида рокефортина. Полосы поглощения метаболита в УФ-спектре, молекулярная масса метаболита 2 (389 Да), его масс-спектр совпадал с таковыми для рокефортина (табл. 1). Этот метаболит имел одинаковую хроматографическую подвижность на пластинах силикагеля в системах (I, II) с заведомым образцом рокефортина. На основании полученных данных метаболит 2 штаммов ВКМ FW-2739, FW-2835, FW-2863, FW-2873 и FW-2877, был идентифицирован как рокефортин. Штаммы ВКМ FW-2739, FW-2863, FW-2873 также синтезировали метаболит 3, который образовывал с реактивом Эрлиха оранжевую окраску, характерную для мелеагрина. Данные УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии метаболита 3 полностью совпадали с таковыми для мелеа-грина (табл. 1). Сравнение хроматографической подвижности выделенного метаболита с образцом ме-леагрина на пластинах силикагеля в системах (I, II) показало полную идентичность двух соединений. У штаммов FW-2739 и FW-2863 помимо основных метаболитов был обнаружен минорный метаболит 4, обладающий низкой хроматографической подвижностью R = 0.05 (I) и дающий синее окрашивание с реактивом Эрлиха. УФ-спектр выделенного метаболита, молекулярная масса метаболита (321 Да) и масс-спектр соответствовали литературным данным для триптофанилдегидрогистидилдикетопи-перазина [6]. У штамма FW-2835 был обнаружен метаболит 5 с R^ = 0.08 (I), развивающий с реакти-
Таблица 1. Физико-химические свойства идентифицированных метаболитов
Номера метаболитов Стандартный образец Окраска с реактивами Хроматографиче-ская подвижность в системах УФ-спектр, ^мак^ нм Молекулярный ион и характеристические пики в МС/МС спектрах
Эрлиха Драгендорфа I II [М - H]- [М + H]+
1 ЦПК Фиолетовая Оранжевая 0.25 0.55 223, 251(пл.), 281, 290 335, 180, 140 337, 182, 196
2 Рокефортин Голубая » 0.2 0.52 238, 325 388, 190 390, 322, 193
3 Мелеагрин Оранжевая » 0.25 0.58 226, 272, 346 432, 404, 363 434, 403, 366
4 Триптофанилди- гидрогистидилди- кетопиперазин Синяя » 0.05 0.22 207, 238, 248, 312 320, 191 322, 193
5 3,12-дигидророке-фортин Голубая » 0.08 0.30 209, 244, 301 390, 322, 205 392, 324
6 Гландиколин А Оранжевая » 0.1 0.38 226, 286, 344 402,333 404, 335
7 Гландиколин Б Оранжевая » 0.1 0.38 226, 286, 344 418, 349, 332 420, 334, 274
8 Агроклавин-I Фиолетовая » 0.18 0.35 223, 276, 282, 292 - 239, 208, 183
9 Эпоксиагрокла-вин-I Фиолетовая » 0.28 0.55 223, 276, 282, 292 25
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.