ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 427, № 1, с. 136-138
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 57.053; 57.054; 57.085.23; 576.3; 576.5
НОВЫЙ БИОРЕГУЛЯТОР, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ КРЫС: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ВЛИЯНИЕ НА ХРЯЩЕВУЮ ТКАНЬ IN VITRO
© 2009 г. Е. Ю. Рыбакова, М. С. Краснов, В. П. Ямскова, Д. В. Маргасшк, С. А. Битко, И. А. Ямсков
Представлено академиком Н.Г. Хрущовым 26.12.2008 г. Поступило 26.12.2008 г.
Обнаруженные ранее в различных тканях млекопитающих биорегуляторы в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10-8-10-12 мг/мл, влияют на клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку, а также стимулируют восстановительные и репаративные процессы в травмированных и в патологически измененных тканях. Их можно выделить в новую ранее не изученную группу биорегуляторов органо-тканевого гомеостаза [1-8]. Установлено, что данные биорегуляторы имеют внеклеточную локализацию [4-8]. Для исследования специфической активности биорегуляторов данной группы были разработаны новые экспериментальные модели роллерного органотипического культивирования тканей тритона in vitro [9]. Показано, что биорегуляторы этой группы оказывают протекторное действие в отношении тканей, которые являются источниками их выделения, при этом их биологическая активность характеризуется отсутствием видовой специфичности. Данные биорегуляторы проявляют сходные физико-химические свойства, важнейшим из которых является их присутствие в виде наночастиц в растворах разной концентрации [3, 5-8].
Целью исследования явилась идентификация в костной ткани млекопитающих биорегулятора данной группы, изучение некоторых его физико-химических свойств и специфического биологического действия. Исследование выполнено на крысах линии Wistar обоего пола массой 200-230 г, которых содержали в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Выделение биорегулятора из костной ткани проводили по методике, разработанной для биорегуляторов этой груп-
пы [1, 3-8]. Получали тканевый экстракт бедренных и плечевых костей после удаления эпифизов и костного мозга в растворе Рингера в течение двух часов при 4°С, далее его дважды высаливали, добавляя сульфат аммония до образования насыщенного раствора. Фракцию супернатанта разделяли либо методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы, либо с помощью ионообменной ДЭАЭ-хроматографии и получали фракцию кислых белков, которая проявляла мембранотропную активность в 10-16-10-17 мг белка/мл [1, 10]. С помощью электрофореза в ПААГ было показано, что основным компонентом данной фракции является низкомолекулярный белок. Применение кругового дихроизма на дихрографе Jasco 720 (Япония) при 190-280 нм позволило выявить, что вторичная структура данного белка характеризуется преимущественным содержанием Р-структур (61.0%) и неупорядоченных участков (32.7%), но низким содержанием а-спи-ралей (6.3%). Методом лазерного динамического светорассеивания установлено, что в водном растворе (концентрация 50 мкг белка/мл) исследуемый белок образует наночастицы размером 87.72 ± 4.39 нм. Полученные данные указывают на сходство физико-химических свойств биорегулятора, выделенного из костной ткани, со свойствами биорегуляторов, идентифицированных в других тканях млекопитающих [2, 3-8, 11].
На новой модели роллерного культивирования регенератов хвостов тритона Pleurodeles waltl (4-5-я стадия) in vitro изучали специфическую активность биорегулятора в дозе, соответствующей 10-16 мг белка/мл и более высокой дозе - 10-8 мг белка/мл. Использовали взрослых половозрелых тритонов обоего пола, взятых в весенне-летний период из аквариальной Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. У животных, наркотизированных в 0.1%-ном растворе MS-222, удаляли фрагмент хвоста длиной 2 см. Через 40 дней регенераты хвоста хирургически удаляли, помещали в стерильную питательную среду для
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва Институт элементоорганических соединений им. А Н. Несмеянова Российской Академии наук, Москва
НОВЫЙ БИОРЕГУЛЯТОР
137
Рис. 1. Регенераты хвостов тритонов на 4-5-й стадии (40 дней после ампутации). а - без культивирования; б - после 14 дней роллерного культивирования без добавления каких-либо факторов (контрольная серия); в - после 14 дней роллерного культивирования с добавлением в среду культивирования биорегулятора, выделенного из кости, в конечной концентрации 10 мг белка/мл (опытная серия < 1); г - после 14 дней роллерного культивирования с добавлением в среду культивирования биорегулятора, выделенного из кости, в конечной концентрации 10 мг белка/мл (опытная серия < 2); увел. ок. 10х, об. 4х.
амфибий, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки крови. В опытной серии №1 в среду культивирования добавляли биорегулятор в дозе, соответствующей 10-6 мг белка/мл; в опытной серии № 2 добавляли биорегулятор в сверхмалой дозе, соответствующей 10-14 мг белка/мл; в контрольной серии в питательную среду ничего не добавляли. Культивирование проводили при температуре 22°С в течение 14 сут, используя роллер RM5 "Assistant" (Германия), скорость вращения 35 об/мин. Культуральную среду меняли каждые 72 ч, вводили в питательную среду двух опытных серий биорегулятор в указанных дозах. Регенераты хвостов тритонов фиксировали на 14-е сут культивирования раствором Буэна и приготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилином-эозином. В интактных регенератах хвостов тритонов на 40-й день после ампутации
обнаруживаются следующие элементы: хорошо выраженная хрящевая ткань, спинной мозг, мышечные волокна, сосуды, формируются подкожные железы, пигментированные клетки звездчатой формы, расположенные под многослойным эпителием кожи, а также множество недифференцированных мезенхимных клеток (рис. 1а). После культивирования данных регенератов в течение 14 сут в контрольной серии наблюдается дегенерация хрящевой ткани, выражающаяся в нарушении упорядоченной структуры хряща и массовой гибели клеток. Элементы спинного мозга выражены неявно. В коже наблюдали большие скопления пигментированных клеток (рис. 16). Состояние тканей регенератов хвостов тритонов, обнаруженное в первой опытной серии, в значительной степени соответствует состоянию ткани в регенератах контрольной серии: хондроциты практически отсутствуют, на их ме-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 427 < 1 2009
138
РЫБАКОВА и др.
сте можно наблюдать скопления клеток с пикно-тическими ядрами. Наблюдаются сохраненные подкожные железы, наполненные секретом, довольно хорошо развиты мышечные волокна. Пигментные клетки представлены в виде отдельных скоплений под эпителием (рис. 1в). Совершенно иное состояние тканей в регенератах второй опытной серии, которое практически соответствует состоянию тканей интактного регенерата, но значительно отличается от регенератов контрольной и первой опытной серий. При воздействии сверхмалых доз биорегулятора, выделенного из кости, наблюдали сохраненную структуру хрящевой ткани, отсутствие гибели клеток, имеет место начало сегментации хряща, характерное для данной стадии регенерации [12]. Под многослойным эпителием в кориуме находятся зрелые железы с секретом. Пигментированные клетки в отличие от контроля образуют небольшие скопления, а не протяженные структуры. Хорошо выражены мышечные волокна, присутствуют малодифференцированные клетки (рис. 1г).
В данном исследовании показано, что биорегулятор, выделенный из кости, оказывает влияние на состояние хрящевой ткани. Обращает на себя внимание тот факт, что в разных концентрациях его биологическое действие проявляется по-разному: в сверхмалых дозах биорегулятор, выделенный из кости, обладает тканеспецифическим действием, поддерживая жизнеспособность клеток и структуру хряща, а в более высокой концентрации данный биорегулятор проявляет протекторное свойство в отношении тканей регенерата, но не оказывает влияния на хрящевую ткань.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ямскова В.П., Резникова М.М. // Журн. общ. биологии. 1991. Т. 52. № 2. С. 181-191.
2. Ямское И.А., Ямскова В.П., Даниленко АН. и др. // ЖРХО. 1999. Т. 43. № 5. С. 34-39.
3. Yamskova V.P., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V. et al. In: Biochemical Physics. Frontal Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 61-70.
4. Yamskova V.P., Krasnov M.S., Rybakova E.Yu. et al. In: Biochemical Physics Frontal Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 71-78.
5. Borisenko A.V., Yamskova V.P., Krasnov M.S. et al. Biochemical Physics Frontal Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 35-44.
6. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V. et al. Biochemical Physics Frontal Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 47-59.
7. Krasnov M.S., Gurmizov E.P., Yamskova V.P., Yamsk-ov I.A. In: Biochemical Physics Frontal Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 21-33.
8. Nazarova PA, Yamskova V.P., Krasnov M.S. et al. In: New Trends in Biochemical Physics Research. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2007. P. 73-82.
9. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. // Изв. АН. Сер. биол. 2003. № 1. С. 22-36.
10. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. // Молекуляр. биология. 1977. Т. 11. № 5. С. 1147-1154.
11. Ямское И.А., Виноградов А.А., Даниленко А Н. и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 1. С. 36-42.
12. Iten L.E., Bryant S.V. // J. Exp. Zool. 1976. V. 196. P. 283-292.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 427 < 1 2009
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.