ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 5, с. 626-628
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 544.165
новый бивалентным положительным аллостерическии
модулятор амра-рецепторов
© 2015 г. М. И. Лавров, В. В. Григорьев, член-корреспондент РАН С. О. Бачурин, В. А. Палюлин, академик РАН Н. С. Зефиров
Поступило 10.03.2015 г.
С помощью компьютерного молекулярного моделирования найден положительный аллостериче-ский модулятор АМРА-рецепторов, обладающий рекордной экспериментально подтвержденной активностью в диапазоне пикомолярных концентраций. Он принадлежит к новому классу бивалентных лигандов АМРА-рецепторов, содержащих каркас 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонана. Предложенная структура может служить основой для дальнейшей оптимизации и создания препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний, улучшения когнитивных функций и памяти.
БО1: 10.7868/80869565215290265
Глутаматергическая система является главной возбуждающей медиаторной системой мозга млекопитающих и в этой связи представляет собой перспективную мишень для создания средств лечения заболеваний ЦНС [1, 2]. Среди большого числа различных типов глутаматных рецепторов значительное внимание в последние годы уделяют изучению подгруппы ионотропных рецепторов, специфическим агонистом которых является (ЯБ)-а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота (АМРА). Лиганды АМРА-рецепторов рассматриваются в настоящее время как потенциальный класс новых лекарственных средств для лечения таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия, эпилепсия, боковой амиотрофический склероз и др. [3—5]. В ряду лигандов рецепторов АМРА особый интерес представляет группа так называемых положительных аллостерических модуляторов (ПАМ) АМРА-рецепторов, улучшающих память и когнитивные функции животных и человека, а также обладающих способностью запускать механизм экспрессии генов, отвечающих за синтез факторов роста нервной ткани, что обеспечивает проявление у этих соединений нейропротекторных свойств [5—8].
Ранее нами была экспериментально исследована серия сравнительно небольших молекул ПАМ, для которых была показана довольно умеренная активность [9]. Докинг таких соединений
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
E-mail: vap@qsar.chem.msu.ru, mst@qsar.chem.msu.ru Институт физиологически активных веществ Российской Академии наук, Черноголовка Московской обл.
в димер глутаматсвязывающего домена АМРА-ре-цептора [10] показал возможность одновременного связывания двух молекул на небольшом расстоянии друг от друга в кармане, расположенном на интерфейсе между двумя субъединицами (рис. 1).
Похожий способ связывания был найден экспериментально (рентгеноструктурные данные) и для комплекса СГ^ [11] с димером глутаматсвязывающего домена АМРА-рецептора.
На основании этих данных нами был разработан принцип конструирования новых активных лигандов, заключающийся в соединении спейсе-ром двух небольших молекул, связывающихся с каждым из двух модуляторных сайтов димера глутаматсвязывающего домена АМРА-рецептора. При этом спейсер должен был обеспечивать необходимое расстояние между "активными фрагментами" таких молекул и позволять им принимать требуемую для оптимального связывания ориентацию, но при этом быть достаточно жестким (например, каркасным). Способ связывания конструируемых бивалентных лигандов с модуляторными сайтами АМРА-рецептора показан на рис. 2.
Конструирование и оптимизацию потенциальных лигандов осуществляли с помощью пакета программ 8УБУЬ-Х2.1 [12]. Молекулярный докинг исследуемых соединений проводили в предполагаемый сайт связывания, расположенный между двумя глобулами двух субъединиц глута-матсвязывающих доменов АМРА-рецептора.
Для поиска наилучшей конформации в полости связывания мишени применяли варьирование торсионных углов лигандов методом синхронного поиска (одновременное варьирование всех торсионных углов). Процедуру докинга осуществляли с помощью программы АиШЭоск 4.2
НОВЫЙ БИВАЛЕНТНЫЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ
627
Рис. 1. Молекулярный докинг производного модулятора CX-516.
[13], обеспечивающей поиск генетического алгоритма и отбор комплексов на основе оценочной функции энергий связывания. Для оптимизации структуры использовали метод моделирования de novo. Он заключается в виртуальном конструировании молекулы и оптимизации ее положения в активном центре биомишени с учетом стериче-ских, электростатических взаимодействий, водородных связей и других факторов, обусловливающих взаимодействие лиганда с белком. В результате был подобран спейсер — каркасная структура на основе 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она, обеспечившая необходимую для оптимального связывания ориентацию двух ацильных заместителей, соответствующие которым исходные "мо-нолиганды" [9, 10] обладали весьма умеренной активностью.
Таким образом, была сконструирована молекула 1, которая, по данным моделирования, хорошо соответствовала по форме карману связывания ПАМ и по оценкам должна была проявлять значительно более высокую активность, чем известные соединения с похожим физиологическим действием.
O
H3C.
CH3
.Г
N
N
O
O O
1
O
L>
O
толщиной 400—600 мкм помещали в термостати-руемую камеру объемом 10 мл. Раствор для выделения имел следующий состав (в мМ): NaCl 150.0, KCl 5.0, CaCl2 2.0, MgS04 • 7H2O 2.0, HEPES 10.0, глюкоза 15.0, pH 7.42. Срезы инкубировали в этом растворе в течение 60 мин, после чего этот раствор заменяли аналогичным раствором, содержащим проназу (2 мг/мл) и коллагеназу (1 мг/мл), и инкубировали в течение 70 мин. После отмывки первоначальным раствором в течение 20 мин срезы помещали в чашку Петри и разъединяли механическим способом при помощи пастеровской пипетки. Растворы непрерывно продували 100%-м О2 при температуре 34°C. Нейроны Пуркинье помещали в рабочую камеру объемом 0.6 мл. Рабочий раствор имел состав (в мМ): 150.0 NaCl, 5.0 KCl, 2.6 CaCl2, 2.0 MgS04 • 7H2O, 10.0 HEPES, 15.0 глюкоза, pH 7.36.
Трансмембранные токи индуцировали активацией АМРА-рецепторов методом быстрой суперфузии путём аппликации растворов агониста этих
Опыты in vitro полностью подтвердили эти предположения. Так, в электрофизиологических экспериментах для соединения 1 начало потен-циирования лежало в области пикомолярных концентраций.
Эксперименты по оценке действия вещества 1 на АМРА-рецепторы были проведены методом patch-clamp на свежеизолированных нейронах Пуркинье, выделенных из мозжечков крыс 12— 15-дневного возраста. Для выделения использовали модифицированный метод. Срезы мозжечка
W" .
ЬЧ
fei
1
Рис. 2. Предпочтительная область связывания положительного аллостерического модулятора с АМРА-рецептором. Обведены "активные фрагменты" и "спейсер" (в центре).
628 ЛАВРОВ и др.
Амплитуда токов в % по отношению к контролю, равному 100% 250 г
200 -
150 -
100 -
50 -
0_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I—
Контроль -11 -10 -9 -8 -7 -6
lg концентрация, моль/литр
Рис. 3. Действие соединения 1 на токи АМРА-рецепторов в нейронах Пуркинье мозжечка крыс, исследованное электрофизиологическим методом patch-clamp; M± m, n = 17.
рецепторов — каиновой кислоты (КК). Поскольку сама АМРА вызывает слишком сильную десен-ситизацию рецепторов, в таких экспериментах и используют КК. Регистрацию токов осуществляли при помощи боросиликатных микроэлектродов (сопротивление 2.0—4.5 МОм), заполненных раствором следующего состава (в мМ): 100.0 KCl, 11.0 ЭГТА, 1.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10.0 HEPES, 5.0 АТФ, pH 7.2. Для регистрации использовали прибор EPC-9 ("HEKA", Германия). Обработку результатов осуществляли при помощи программы Pulsefit ("HEKA").
Аппликация КК в нейронах Пуркинье индуцирует трансмембранные входящие токи. Мы обнаружили, что добавление в перфузируемый раствор соединения 1 приводит к зависимому от концентрации 1 увеличению амплитуды токов (рис. 3). Этот эффект мы зарегистрировали в диапазоне низких концентраций 1: 10-11—10-9 М. При использовании больших концентраций 1 значения амплитуды токов возвращались к контрольному уровню.
Резюмируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что соединение 1 проявляет ярко выраженный эффект, свойственный для аллостерических модуляторов АМРА-рецепторов. Наряду с этим, эффективные дозы представленного соединения значительно ниже, чем для практически всех известных на данный момент ПАМ АМРА-рецепторов (например, [14, 15]). Это дает надежду на то, что при дальнейшей оптимизации структуры удастся создать препарат широкого спектра действия для лечения и профилактики нейродегенеративных и психоневрологических заболеваний, а также для стимуляции памяти и улучшения когнитивных функций человека.
Авторы выражают благодарность за поддержку данной работы в рамках программы Президиума РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Watkins J.C., Evans R.H. // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1981. V. 21. P. 165-204.
2. Lapidus K.A., Soleimani L, Murrough J. W. // Novel Glutamatergic Drugs for the Treatment of Mood Disorders // Neuropsychiatr. Dis. Treat. 2013. V. 9. P. 1101-1112.
3. O'Neill M.J., Witkin J.M. // Curr. Drug Targets. 2007. V. 8. № 5. P. 603-620.
4. Bleakman D., Alt A., Witkin J.M. // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2007. V. 2. P. 117-126.
5. ГригорьевВ.В., Прошин А.Н., Кинзирский А.С., Бачу-рин С.О. // Успехи химии. 2009. Т. 78. № 5. С. 524-534.
6. Lynch G., Gall C.M. // Trends Neurosci. 2006. V. 29. № 10. P. 3-9.
7. Francotte P., de Tullio P., Fraikin P., et al. // Recent Pat. CNS Drug Discov. 2006. V. 1. № 3. P. 239-246.
8. Arai A.C., Kessler M. // Curr. Drug Targets. 2007. V. 8. № 5. P. 583-602.
9. Лавров М.И., Лаптева В.Л., Григорьев В.В. и др. // Хим.-фарм. журн. 2012. Т. 46. № 2. С. 27-30.
10. Тихонова И.Г., Лавров М.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. // ДАН. 2004. Т. 399. № 2. С. 268-270.
11. Jin R., Clark S, Weeks A. M, et al. // J. Neurosci. 2005. V. 25. P. 9027-9036.
12. SYBYL-X 2.1. 2013. www.certara.com
13. Morris G.M., Huey R., Lindstrom W, et al. // J. Com-put. Chem. 2009. V. 30. P. 2785-2791.
14. Timm D.E., Benveniste M, Weeks A.M., et al. // Mol. Pharmacol. 2011. V. 80. P. 267-280.
15. Harms
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.