ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 354-360
УДК 577.112.824.825:577.2
НОВЫЙ ПОДХОД К ОСВОБОЖДЕНИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ОТ АЛЬБУМИНА И ИММУНОГЛОБУЛИНА G
© 2015 г. Е. А. Бормотова, Б. Л. Мильман, Т. В. Гупалова
Институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург, 197376
e-mail: tvgupalova@rambler.ru Поступила в редакцию 14.10.2014 г.
Применение протеомного анализа для поиска потенциальных диагностических биомаркеров ограничено присутствием в крови пациентов сывороточного альбумина (ЧСА) и иммуноглобулина (IgG) в высоких концентрациях, которые мешают обнаружению их в сыворотке белков, обладающих близкой с ними молекулярной массой. Рекомбинантные ЧСА- и IgG-связывающие полипептиды были использованы в качестве лигандов при создании сорбентов для полного удаления этих белков методом аффинной хроматографии. Сорбенты обладали высокой специфичностью связывания ЧСА и IgG по сравнению с традиционно применяемыми антителами. Был получен комбинированный сорбент, позволяющий удалять в одну стадию аффинной хроматографии ЧСА и IgG из сыворотки крови. Созданные сорбенты использованы для подготовки сыворотки крови для про-теомного анализа.
Ключевые слова: протеомика, рекомбинантный ЧСА-связывающий и 1§О-связывающий полипептиды, аффинная хроматография, диагностические биомаркеры.
Б01: 10.7868/80555109915030046
В последние годы при разработке методов диагностики различных заболеваний используются протеомные технологии. Они позволяют обнаружить и идентифицировать определенные соединения или их комплексы, присутствующие только в пораженных тканях или клетках и/или выделяющиеся во внешнюю среду или внутренние среды организма при различных заболеваниях, и которые можно использовать в диагностике в качестве маркеров. Протеомный анализ позволяет обнаружить до 10000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их содержания, что дает возможность проводить диагностику и мониторинг течения заболевания. При использовании протеомных технологий можно получать информацию о всех белках, присутствующих в биологических жидкостях (плазме или сыворотке крови, спинномозговой, синовиальной, амниотической, бронхоальвеолярной жидкости и моче), клетках и биоптатах тканей человека, а также протеомах микроорганизмов — возбудителей заболеваний [2], и сравнивать их состав у различных пациентов, например, у больных и здоровых.
При использовании протеомных технологий на первой стадии проводится двумерный электрофорез (2-ДЭ) в полиакриламидном геле, на второй — идентификация белков с помощью различных методов масс-спектрометрии. Для выяв-
ления биомаркеров сравнивают в геле интенсивность окраски компонентов, полученных от различных пациентов. Затем компоненты, которые существенно различаются между группами сравнения, элюируют из геля и идентифицируют масс-спектрометрическим методом [1].
Для диагностики заболеваний наиболее удобна и доступна сыворотка (плазма) крови. Плазма находится в состоянии динамического равновесия, и любой сдвиг этого равновесия отражает изменения в функционировании организма. Состав соединений в сыворотке крови может характеризовать физиологическое и клиническое состояние пациента. Например, уровень холестерина, гормонов, ферментов или других белков может предоставить информацию о сердечно-сосудистых заболеваниях, пищевом статусе, вирусной патологии или раке. В связи с этим в настоящее время осуществляется поиск новых, достоверных биомаркеров для диагностики различных заболеваний, в том числе, маркеров белково-пептидной природы. Присутствие в сыворотке солей и множественных форм белков, среди которых более 80% составляют альбумин (ЧСА) и иммуноглобулин О (IgG), значительно затрудняет анализ белковых компонентов. Однако именно соотношение минорных компонентов в плазме существенно для диагностики [1].
В большинстве случаев для удаления ЧСА используют лиганд Cibacron blue, который не специфически связывает другие сывороточные белки, удаление которых может исказить результаты анализа 2-ДЭ [3]. Для увеличения специфичности сорбентов стали использовать в качестве ли-ганда антитела к ЧСА [4]. Этот сорбент оказался не рентабельным вследствие его низкой емкости и высокой стоимости.
Содержащийся в сыворотке в высокой концентрации IgG, при проведении 2-ДЭ разделяется на два компонента с молекулярными массами 25 кДа (легкие цепи) и 50 кДа (тяжелые цепи) [5]. Для удаления IgG из сыворотки используют как антитела к IgG, так и монофункциональный белок G [6]. В последнее время появились коммерческие наборы, в которые входят аффинные колонки с сорбентами, содержащими антитела к ЧСА и IgG [7]. При использовании этих сорбентов помимо ЧСА и IgG удаляются и многие другие сывороточные белки, что свидетельствует о недостаточной специфичности использованных антител [8]. В связи с этим, поиск более специфичных лигандов к ЧСА и IgG является важной задачей.
На поверхности клеточной стенки стрептококков групп C и G, выделенных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей человека, экспрессируется белок G, который связывается с ЧСА и IgG по участкам, расположенным на концевых областях его молекулы [9, 10]. Некоторые штаммы стрептококка группы G, выделенные из коровьего молока, в отличие от штаммов стрептококка группы G, выделенных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей человека, не связывают иммуноглобулин G, но по способности связывать ЧСА превосходят их [11].
Фрагменты гена, отвечающие за связывание ЧСА и IgG, были клонированы и экспрессирова-ны в Escherichia coli [12, 13]. Полученные реком-бинантные белки нашли применение в медицинской практике. Например, IgG-связывающая часть белка G, наряду с другим хорошо известным бактериальным белком — белком А из Staphylococcus aureus, используется в качестве чувствительного реагента для определения уровня IgG в сыворотке или плазме крови [14, 15]. Эти рекомбинантные белки обладают высокой чувствительностью и низкой неспецифической активностью по сравнению с традиционно используемыми для этих целей вторичными антителами [16].
Белки, способные связывать ЧСА, могут использоваться как аффинные лиганды для выделения высокоочищенного ЧСА из сыворотки крови [12], для количественного определения ЧСА в различных биологических жидкостях [13, 17], а также для создания гибридных белков, в которых ЧСА-связывающие белки соединяются с трудно
выделяемыми рекомбинантными белками для их последующей очистки [18].
Цель работы — исследование эффективности применения рекомбинантных IgG- и ЧСА-свя-зывающих полипептидов для освобождения сыворотки крови человека от IgG и ЧСА.
МЕТОДИКА
В работе использовали рекомбинантные IgG-и ЧСА-связывающие полипептиды, которые получены, как описано ранее [13, 19], сефарозу 4В, активированную бромцианом, ("Sigma", США), колонки (1.5 х 5 см, "Bio-Rad", США), нитроцел-люлозные мембраны (НЦ, "Bio-Rad", США), готовый жидкий субстрат для мембран 3,3',5,5'-тет-раметилбензидин (ТМБ, "Sigma", США), белки-маркеры молекулярных масс ("Fermentas", Литва).
Рекомбинантные IgG- и ЧСА-связывающие полипептиды (10 мг) иммобилизовали на 2 мл се-фарозы 4В, активированной бромцианом, в 0.1 М бикарбонатном буфере, рН 8.3, содержащем 0.5 M NaCl, согласно инструкции производителя.
Сорбенты промывали в колонках (1.5 х 5 см) последовательно 0.1 M ацетатным буфером, pH 4.0, и 0.1 М бикарбонатным буфером, рН 8.3, содержащим 0.5 М NaCl, затем уравновешивали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.85% NaCl, (ФСБ) и хранили при 4°С.
Сыворотку крови человека смешивали в соотношении 1 : 1 (об./об.) с ФСБ и наносили на сорбенты. Не связавшиеся белки элюировали ФСБ, связавшиеся с сорбентами 0.1 М глициновым буфером, рН 2.2. Во фракциях, объемом 400 мкл, определяли оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Фракции с высокими значениями ОП объединяли и значение рН доводили 2.0 М NaOH до 7.5.
Содержание ЧСА и IgG определяли методами блоттинга, электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) и 2-ДЭ.
Электрофорез по методу Лэммли [20] проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии 0.1% ДДС-Na на приборе "Bio-Rad" (США).
2-ДЭ проводили, как описано [1]. Для изо-электрофокусирования на полосках (стрипах) с иммобилизованным градиентом pH 3—10 ("BioRad", США) использовали прибор PROTEAN® IEF System "Bio-Rad" (США). Разделение белков проводили в течение 15 мин при напряжении 250 В, затем в течение 3 ч напряжение линейно повышали до 4000 В и продолжали процесс в течение 10 ч при 4000 В до достижения 20000 В ч. Нагрузка белка на данный тип стрипов составляла 100 мкг.
Для блоттинга на две НЦ мембраны наносили исследуемый материал, разведенный в 2 раза ФСБ. Мембраны помещали в 2%-ный раствор
Рис. 1. Блоттинг на нитроцеллюлозных мембранах после инкубации с мечеными ЧСА (а) и IgG (б) исходной сыворотки крови (1), белков (2), связавшихся с аффинным сорбентом, содержащим в качестве ли-ганда ЧСА (а) или IgG (б), и сыворотки после аффинной хроматографии (3).
кДа 120 -
85 -
50
35 -25 -
Рис. 2. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na исходной сыворотки крови (2), фракции сыворотки после удаления ЧСА и IgG последовательной аффинной хроматографией на сорбентах с IgG- и ЧСА-свя-зывающими полипептидами (3), IgG (4) и ЧСА (5), очищенных аффинной хроматографией, 1 — белки-маркеры молекулярных масс.
обезжиренного сухого молока в ФСБ (блокирующий раствор) и инкубировали 40 мин. Мембраны переносили в блокирующие растворы, один из которых содержал пероксидазу хрена, конъюги-рованную перйодатным методом [21] с ЧСА-связы-вающим, а другой — с IgG-связывающим полипептидами, и инкубировали в течение 40 мин. Затем мембраны последовательно промывали блокирующим раствором и ФСБ 3 раза по 5 мин. Отмытые мембраны высушивали на воздухе и помещали в раствор субстрата пероксидазы ТМБ. После инкубации в течение нескольких секунд определяли компоненты, содержащие пероксидазу, по появлению синей окраски.
Для масс-спектрометрического анализа методом МАЛДИ (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation) к 1.0 мкл раствора белка в ди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.