УДК 577.27
НОВЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНТИ-HER2/neu ИММУНОТОКСИН: ПОЛУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ
© 2014 Е.А. Соколова12*, Т.А. Здобнова12, О.А. Стремовский2, И.В. Балалаева1, С.М. Деев12
1 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950 Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23; факс: (831)462-3085, электронная почта: unn@unn.ru, malehanova@mail.ru
2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва
Поступила в редакцию 07.07.14
Получен новый НЕЯ2/пеи-специфичный рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40, в котором антитело 4D5scFv (направляющий модуль) соединено с фрагментом псевдомонадного экзотоксина А (эффек-торный модуль) в единую полипептидную цепь с помощью гибкого линкера. Полученный иммунотоксин сохранил специфичность и аффинность, характерную для исходного антитела 4D5scFv, и продемонстрировал высокую избирательную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам, гиперэкспрессирую-щим онкомаркер HER2/neu. Результаты экспериментов in vitro на культуре клеток, а также in vivo, на живот-ных-опухоленосителях, свидетельствуют о высоком потенциале 4D5scFv-PE40 для таргетной терапии опухолей с гиперэкспрессией HER2/neu.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рекомбинантный иммунотоксин, 4D5scFv, псевдомонадный экзотоксин А, онкомаркер HER2/neu, таргетная терапия.
В последнее десятилетие все большую роль в лечении злокачественных новообразований играет таргетная (от англ. «target» — мишень) терапия. Данный подход основан на использовании агентов адресного действия, избирательно связывающихся с опухолевыми клетками и вызывающих их гибель.
Развитие таргетной терапии тесно связано с прогрессом в молекулярной онкологии, сопровождающимся идентификацией молекулярных мишеней, характерных для опухолевых клеток определенного типа, а также с совершенствованием методов диагностики молекулярного профиля опухоли. Идеальным вариантом таких мишеней являются белки, экспрессирующиеся на поверхности цитоплазматической мембраны и обладающие способностью к интернализации. Перспективными мишенями являются мембранные гли-копротеины (например, мезотелин) и мембранные рецепторы (например, трансферриновые рецепторы и рецепторы факторов роста) [1].
Трансмембранный клеточный рецептор HER2/neu является одним из наиболее изученных опухолевых маркеров и успешно апробированной мишенью таргетной терапии [2]. Полно-
* Адресат для корреспонденции.
размерное гуманизированное моноклональное антитело 4Б5 против ИЕК2/пеи, известное также как трастузумаб, широко используется в клинической практике под коммерческим названием Иегсерйп® и является «золотым стандартом» таргетной терапии солидных опухолей [3]. Кроме того, в 2012 г. в клиническую практику был введен еще один ИЕЯ2-специфичный препарат — Peгjeta® на основе антитела, узнающего другой эпитоп этого онкомаркера.
Стремление повысить эффективность противоопухолевого действия антител привело к появлению следующего поколения таргетных препаратов — иммунотоксинов, представляющих собой соединения, состоящие из двух структурно и функционально независимых модулей: нацеливающего, специфически связывающегося с мишенями, и эффекторного (цито-токсического). В случае, когда оба структурно-функциональных модуля представлены белковыми молекулами, они могут быть объединены в единую полипептидную цепь методами генной инженерии. Преимуществами таких рекомби-нантных иммунотоксинов являются гомогенность состава, легкость наработки в бактериальных продуцентах и сохранение функциональных свойств его модулей [4].
1680
В данной работе на основе HER2/neu-cne-цифичного антитела 4D5scFv и фрагмента псев-домонадного экзотоксина А (PE40) получен новый рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40 и исследована его противоопухолевая эффективность in vitro и in vivo.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспрессия, выделение и очистка иммуноток-сина. Плазмида pSD-4D5scFv-PE40, кодирующая ген рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40, была получена на основе плазмиды pSD-4D5-barnase [5]. Фрагмент ДНК, кодирующий PE40, амплифицировали с плазмиды pIG6-4D5MOCB-ETA [6] с использованием прайме-ров 5'-actacGGCGCGCCGGAGTTCCCGAAA-CCGTCCAC и 5'-tgcgtAAGCTTCTACAGTTCG-TCTTTATGGTG. Полученный фрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AscI и HindIII («Fermentas», США) и клонировали в плазмиду pSD-4D5-barnase вместо гена барназы.
Для наработки рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в бактериальных продуцентах, клетки Escherichia coli штамма (BL21) трансформировали плазмидой pSD-4D5scFv-PE40, содержащей ген соответствующего белка под контролем lac-промотора. Свежетрансфор-мированные бактерии культивировали в среде YTPS (1%-ный дрожжевой экстракт, 1%-ный триптон, 0,5%-ный NaCl, 80 мМ K2HPO4, 20 мМ KH2PO4) при 28о до достижения оптической плотности культуры при 550 нм 0,8 ОD и индуцировали lac-промотор добавлением изопро-пил-1-тио^^-галактозида до конечной концентрации 0,5 мМ. Затем бактерии культивировали при интенсивном перемешивании в течение 12 ч при 28° и осаждали центрифугированием.
Осадок бактерий, содержащий целевой белок 4D5scFv-PE40, ресуспендировали в буфере УЗ (20 мМ Tris-HCl, 10 мМКИ^О^ 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, pH 8,0). Клетки лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора Labsonic P («Sartorius», Германия), полученный клеточный экстракт центрифугировали в течение 10 мин при 4° и 18 500 g.
Надосадочную жидкость, содержащую растворимую форму целевого белка 4D5scFv-PE40, очищали на колонке «HisTrapFF 1 ml» («GE Healthcare», США) в нативных условиях, согласно инструкциям производителя. Иммобилизованный на колонке белок элюировали градиентом имидазола от 0 до 200 мМ. Собранные фракции, содержащие нужный белок, затем очищали методом ионообменной хроматографии на колонке «QSepharoseFF 1 ml» («GE Healthcare», США),
согласно инструкциям производителя; целевой белок элюировали градиентом хлорида натрия от 25 до 500 мМ. Фракции, содержащие целевой белок, анализировали с помощью электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях, согласно стандартному протоколу.
Определение константы диссоциации полученного иммунотоксина. Константу диссоциации комплекса иммунотоксина 4D5scFv-PE40 с рецептором HER2/neu определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием оптического биосенсора BIAcore 3000 («GE Healthcare», США). Рекомбинантный белок p185HER2-ECD («Sino Biological», Китай), представляющий собой внеклеточный домен рецептора HER2/neu, ковалентно иммобилизовали на поверхности карбоксиметил-декстрано-вого чипа CM5, согласно инструкциям производителя. Плотность рецептора на чипе составляла 4500 у.е.
Иммунотоксин был использован в четырех концентрациях (1 мкМ, 330, 110 и 37 нМ) в буфере HBS-PE (0,1 M HEPES, pH 7,4; 0,15 M NaCl; 3 мМ ЭДТА; 0,005%-ный Tween Т-20). Сенсограммы получали при скорости потока 5 мкл/мин при 25°. Фаза диссоциации продолжалась 20 мин. Результаты обрабатывали с помощью программы «BIAevaluation Software».
Оценка цитотоксичности иммунотоксина. В работе использовали модифицированные клетки аденокарциномы яичника человека линии SKOV-3 (номер по каталогу ATCC - HTB-77) -SKOV-kat, характеризующиеся гиперэкспрессией рецептора HER2/neu, и HER2/neu-отрица-тельные клетки яичника китайского хомячка CHO (номер по каталогу ATCC — CCL-61).
Клетки выращивали в среде RPMI-1640 («HyClone», США) с 10%-ной эмбриональной сывороткой теленка («HyClone», США) и 2 мМ глутамином («ПанЭко», Россия) при 37° в атмосфере 5%-ной СО2. Для предотвращения ферментативного удаления поверхностных рецепторов при субкультивировании снятие клеток с подложки проводили раствором Версена («ПанЭко», Россия) без использования трипсина.
Для анализа цитотоксичности иммуноток-сина суспензию клеток в количестве 4 х 103 (SKOV-kat) или 6 х 103 (CHO) клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение ночи, после чего ростовую среду удаляли. К клеткам добавляли белок 4D5scFv-PE40 или один из его модулей (4D5scFv или PE40) в различных концентрациях (от 1 пМ до 1 нМ) в фосфатно-солевом буфере (PBS) («ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение 40 мин при 4°. По окончании времени инкубации несвязавшийся иммунотоксин отмывали
PBS, к клеткам добавляли ростовую среду и выращивали в течение 48 ч.
Жизнеспособность клеток после их обработки иммунотоксином оценивали с помощью стандартного МТТ-теста [7]. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение оптической плотности обработанных клеток к оптической плотности необработанных, выраженное в процентах. Обработку данных и расчет IC50 (концентрации иммунотокси-на, уменьшающей жизнеспособность клеток в два раза относительно контроля) проводили с использованием программы GraphPadPrism 6 (GraphPad Software).
Оценка противоопухолевого эффекта иммуно-токсина in vivo. Для создания модели опухоли человека с гиперэкспрессией рецептора HER2/neu были использованы иммунодефицитные мыши линии BALB/c-Nude (самки, 17—23 г, 4—6 недель), полученные из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (г. Пущино). Для получения ксенографтных опухолей суспензию клеток SKOV-kat в PBS смешивали с ростовым субстратом Matrigel («BD Biosciences», США) в соотношении 1 : 1 (по объему) и вводили подкожно под правую лопатку в количестве 2 х 106 клеток на животное.
Гиперэкспрессию рецептора HER2/neu в опухолевой ткани подтверждали методом имму-ногистохимического анализа c использованием набора HercepTest («Dako», «Agilent Technologies», США).
Животные были поделены на 4 группы по 5 мышей в каждой. Животным первой группы (контрольной) через 24 ч после инъекции опухолевых клеток вводили внутрибрюшинно 0,1 мл PBS. Животным второй группы однократно вводили 4D5scFv-PE40 (58 пмоль/животное), растворенный в 0,1 мл PBS. Третьей группе животных троекратно на 3, 5 и 7 дни после инъекции опухолевых клеток вводили препарат для химиотерапии цисплатин (разовая доза — 0,06 мг/жи-вотное в 0,1 мл PBS). Животным четвертой группы вводили 4D5scFv-PE40 и цисплатин по указанным выше схемам.
Начиная с 6-го дня, опухолевые узлы измеряли два раза в нед
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.