Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2004, том 30, № 4, с. 441^45
УДК 547.415.057
НОВЫЙ СИНТЕЗ а-МЕТИЛСПЕРМИДИНА
© 2004 г. Н. А. Григоренко*, Й. Вепсалайнен**, А. Ярвинен***, Т. А. Кейнанен***, JI. Алхонен***, Ю. Янне***, А. М. Крицын*, А. Р. Хомутов*"
* Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, 32; **Департамент химии, Университет г. Куопио, Куопио, Финляндия; ***Центр наук о молекулах им. А.И. Виртанена, Куопио, Финляндия Поступила в редакцию 14.07.2003 г. Принята к печати J5.02.2004 г.
Исходя из этилового эфира (3-аминомасляной кислоты осуществлен с высоким выходом пятиста-дийный синтез а-метилспермидина - первого аналога полиаминов, способного предотвращать патологические последствия истощения внутриклеточного пула спермидина в трансгенных крысах, суперпродуцирующих спермин/спермидин-Л'1-ацетилтрансферазу.
Ключевые слова: полиамины, а-метилспермидин, спермин!спермидин-N1 -ацетилтрансфераза.
ВВЕДЕНИЕ
Биогенные полиамины спермин, спермидин и их предшественник путресцин присутствуют в значительных количествах в животных клетках всех типов и являются необходимым фактором нормального клеточного роста и дифференци-ровки. Разнообразие и жизненная важность клеточных функций полиаминов позволяют рассматривать их как универсальные низкомолекулярные регуляторы клеточного метаболизма. По сравнению с нормальными опухолевые клетки имеют повышенный уровень полиаминов, а его понижение приводит к замедлению роста и гибели этих клеток [1].
Метаболизм полиаминов тесно связан с превращениями орнитина и метионина и включает в себя несколько ферментов (схема 1), ключевыми из которых на путях биосинтеза являются декар-боксилазы орнитина и 5-аденозилметионина, а на путях катаболизма - спермин/спермидин-А^-аце-тилтрансфераза (ЗБАТ). Биосинтез и деградация этих трех короткоживущих ферментов легко индуцируются в ответ на изменения внутриклеточной концентрации полиаминов [1].
Известны две основные стратегии истощения внутриклеточного пула полиаминов. Первый под-
Сокращения: Ме1(Ас1о) - 5-аденозилметионин; аМеврс! -а-метилспермидин (1,8-диамино-5-азанонан); Огп - орни-тин; РАО - полиаминооксидаза; Рш - путресцин (1,4-диа-минобутан); Брс! - спермидин (1,8-диамино-5-азаоктан); 8рт - спермин (1,12-диамино-4,9-диазадодекан); БЗАТ -спермин/спермидин-^'-ацетилтрансфераза. #Автор для переписки (тел.: (095) 135-6065; эл. почта: alexWiom@genome.eimb.relarn.ru; факс: (095) 135-1405).
ход основан на ингибировании орнитин и 5-адено-зилметионин декарбоксилаз (см. обзоры [2, 3]). В этом случае рост клеток восстанавливается после добавления в среду спермидина (8рс1) или спермина (Брш), что подтверждает специфичность действия ингибиторов. Однако существенно более эффективен второй подход, заключающийся в активации клеточного катаболизма полиаминов. Для этой цели был синтезирован набор бисалкилированных по концевым аминогруппам производных спермина, которые активно переносятся в клетки системой транспорта полиаминов и индуцируют биосинтез 88АТ, что приводит к истощению пула 5рс1/8рт и торможению клеточного роста (см. обзоры [4, 5]). Были получены клеточные линии, суперэкспрессирующие БЗАТ, а также 88АТ-трансгенные животные [6-8]. Однако оказалось, что в случае супериндукции 88АТ экзогенные полиамины не способны восстанавливать рост клеток из-за высокой скорости внутриклеточного катаболизма полиаминов.
Вместе с тем, для дискриминации полиаминза-висимых метаболических нарушений и нарушений, прямо не связанных с истощением пула полиаминов, но являющихся следствием активации их катаболизма, необходимы метаболически устойчивые соединения полиаминной природы, способные выполнять основные клеточные функции полиаминов и восстанавливать рост и жизнеспособность клеток с супериндуцированной 88АТ. Значение подобных веществ велико еще и потому, что регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможности вызывать необходимый ответ клетки или организма, но и наличие способов обращать эффект, в том числе и
nh2 — h2n
но он
Met(Ado)
НО ОН S-аденозклметионинамин
Spd
^ - 5 /HN NH v NH> Ас
,NH
ОН
nh2
От
~NH
/V1-Ac-Spd
4NHi
Spm
N'-Ac-Spm
"NH-,
Схема 1. Метаболизм полиаминов [1]. 1 - Ме[(Ас1о)-декарбоксилаза (КФ 4.1.1.50); 2 - Om-декарбоксилаза (КФ 4.1.1.17); 3 - Spd-синтаза (КФ 2.5.1.16); 4 - Spm-синтаза (КФ 2.5.1.22); 5 - SSAT (КФ 2.3.1.57); 6-РАО (КФ 1.5.3.11).
с помощью химических соединений. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свидетельствует об адекватности наших представлений о том или ином биохимическом процессе. Однако в литературе не описаны аналоги полиаминов, способные поддерживать рост и жизнеспособность клеток на фоне супериндукции ББАТ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Инкубация животных клеток с а,а-дифторме-тилорнитином, который является необратимым ингибитором декарбоксилазы Огп - ключевого фермента биосинтеза полиаминов, приводит к истощению внутриклеточного пула Pi.it/Spd и торможению роста клеток. При этом добавление в культуральную среду спермидина полностью восстанавливает рост клеток. В случае клеток Ы210 и НТ29, обработанных а,а-дифтормети-лорнитином, было показано, что подобным свойством обладает также аМеБрс! (1,8-диамино-5-азанонан) [9].
Напротив, активация катаболизма полиаминов посредством супериндукции ББАТ приводит к истощению внутриклеточного пула не Ри^рё, а Брш/Зрс! и торможению роста клеток. В этом случае добавление в среду спермидина или спермина не приводит к восстановлению роста и жизнеспособности клеток из-за высокой скорости деградации полиаминов. До настоящего времени не было известно ни одного аналога полиаминов, способного восстанавливать рост клеток с супериндуци-рованной 58АТ и возможность использования для
этих целей aMeSpd, тем более в экспериментах ш vivo, априори представлялась не вполне очевидной.
Недавно на примере SSAT-трансгенных крыс мы показали, что aMeSpd способен предотвращать развитие острого панкреатита, вызванного истощением пула полиаминов в результате супериндукции SSAT, а также стимулировать раннюю регенерацию печени после частичной гепатоэк-томии [10].
Единственный описанный в литературе метод получения aMeSpd представляет собой восьми-стадийный процесс, а целевой aMeSpd получен в количестве нескольких десятков миллиграммов с суммарным выходом 6% [9]. Отмеченные авторами работы [9] проблемы с растворимостью ключевых промежуточных соединений, а также трудоемкие процедуры выделения и очистки продуктов на последних стадиях делают масштабирование этого синтеза вряд ли целесообразным.
В настоящей работе мы описываем простой пятистадийный синтез aMeSpd (IV), позволяющий получать аналог с суммарным выходом 46%, считая на исходный этиловый эфир (3-аминомас-ляной кислоты (схема 2), в количествах, необходимых для проведения экспериментов с лабораторными животными.
В последнее время для образования C-N-связи в полиаминах в основном используется алкилиро-вание сульфамидов, реже - избытка незащищенного амина, соответствующим алкилгалогенидом (см. обзор [11]). По сравнению с аминоалкилгало-генидами аминоспирты или их предшественники, как правило, более доступны, а алкил(арил)сульфо-
НОВЫЙ СИНТЕЗ СС-МЕТИЛСПЕРМИДИНА 443
(III) aMeSpd (IV)
Схема 2. ¡' - LiAlH^HF/A; ii - Cbz-Cl/H20/NaHC03; iii - Ms-Cl/Et3N/CH2Cl2; iv - H2N(CH2)4NH2/THF; v - H2/Pd.
наты соответствующих /V-защищенных аминоспир-тов являются эффективными алкилирующими агентами. Ранее алкилирование избытка тримети-лендиашша тозилатом 7-этоксиэтилиденаминоок-си-4-(/У-бензилоксикарбонил )-4-азагептанола-1 было успешно использовано нами в синтезе 11-ами-ноокси-4,9-диаза-1 -аминоундекана [12].
Основной интермедиат в синтезе aMeSpd (IV) -/V-Cbz-3-аминобутанол (И), был приготовлен восстановлением коммерчески доступного этилового эфира ß-аминомасляной кислоты действием LíA1H4 в THF и последующим М-карбобен-зоксилированием полученного 3-аминобутанола (I). Для алкилирования 1,4-диаминобутана, являющегося ключевой стадией синтеза aMeSpd, нами был применен метансульфонат /V-Cbz-3-аминобутанола (II), который использовался далее без дополнительной очистки. Алкилирование 1,4-диаминобутана проводили при 0°С, что уменьшало количество побочных продуктов, трудно отделяемых от yV-Cbz-aMeSpd (III) и позволяло получать соединение (III) с выходом 72%.
Каталитическое гидрирование /V-Cbz-aMeSpd (III) осуществляли при атмосферном давлении над Pd-чернью и после кристаллизации из водного спирта целевой тригидрохлорид aMeSpd (IV) был выделен с выходом 89%. Синтезированный таким способом aMeSpd, по данным ВЭЖХ, в стандартных условиях анализа полиаминов [13] имел чистоту 99.6%.
Следует отметить, что предлагаемая схема синтеза также пригодна для получения L- и D-изо-меров aMeSpd, которые могли бы проявлять различную активность in vitro и in vivo.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали: этиловый эфир ß-ами-номасляной кислоты, 1,4-диаминобутан (Aldrich, США), Cbz-Cl, хлорангидрид метансульфокисло-ты (Fluka, Швейцария), LiAlH4 (Sigma, США). ТСХ
проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системах: СНС13-МеОН, 9 : 1 (А); ди-оксан-25% NH4OH, 9 : 1 (Б); н-ВиОН-АсОН-пири-дин-Н20, 4:2:1:2 (В). Колоночную хроматографию выполняли на силикагеле Kieselgel (40-63 мкм, Merck, Германия), системы для элюции указаны в тексте. Вещества на хроматограммах обнаруживали по УФ-поглощению и цветной реакцией с нингидрином.
Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker Avance 500 DRX (Германия), в качестве внутреннего стандарта использовали Me4Si (CDC13) и натриевую соль 3-триметилсилилпропансульфокис-лоты (D20). Химические сдвиги приведены в миллионных долях, а КССВ - в герцах.
З-Аминобутанол-1 (I). К суспензии 8.0 г (0.21 моль) LiAlH4 в 150 мл абс. THF при охлаждении и перемешивании прибавляли по каплям раствор 13.5 г (0.103 моль) свежеперегнанного этилового эфира [3-аминомасляной кислоты в 50 мл абс. THF с такой скоростью, чтобы растворитель слабо кипел. По окончании прибавления реакционную смесь кипятили при перемешивании еще 3 ч, оставляли на ночь при комнатной темпера
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.