Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 2, с. 131-144
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ =
УДК 577.112.824:615.917
О ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬБУМИНА
© 2015 г. Н. В. Гончаров*, **, #, Д. А. Белинская*, А. В. Разыграев***, А. И. Уколов**
*ФГБУНИнститут эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН 194223 Россия, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44
**ФГУП "НИИгигиены, профпатологии и экологии человека"ФМБА России, Санкт-Петербург
***ФГБУ "Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук
Поступила в редакцию 04.06.2014 г. Принята к печати 13.08.2014 г.
Молекула альбумина, в отличие от молекул многих других плазменных белков, не покрыта углеводной оболочкой и играет важнейшую роль в поддержании коллоидно-осмотического давления крови, может связывать и транспортировать различные молекулы эндогенного и экзогенного происхождения. В обзоре представлены примеры ферментативной активности альбумина, существование которой большинством исследователей пока еще воспринимается скептически; рассматривается история вопроса, при этом особое внимание уделено эстеразной активности альбумина. Приведены кинетические и термодинамические характеристики взаимодействия альбумина с некоторыми субстратами, рассмотрена возможность отнесения альбумина к определенным классам и номенклатуре ферментов.
Ключевые слова: ферменты, альбумин, эстеразы, тиолпероксидазы, фосфорорганические соединения, докинг.
DOI: 10.7868/S0132342315020049
ВВЕДЕНИЕ
Об альбумине, казалось бы, известно все. Уже хотя бы потому, что это главный белок крови млекопитающих, где его концентрация составляет 500—700 мкМ. Первые публикации, посвященные исследованию сывороточного альбумина, датируются концом XIX века [1, 2]. К середине XX века ежегодно публиковали десятки работ, в 1960-х — сотни, а в 1970-х их счет перевалил за тысячу. Удивительно при этом, что трехмерная структура альбумина сыворотки крови человека была исследована с высоким разрешением довольно поздно, лишь в 1990-х [3, 4]. И если со структурой этого общеизвестного белка оказалось не все так просто и быстро, стоит ли удивляться проблемам, связанным с его функциональной активностью, которые являются предметом нашего исследования и обсуждаются в
Сокращения: АХЭ — ацетилхолинэстераза, БХЭ — бути-рилхолинэстераза, КЭ — карбоксилэстераза, ФОВ — фосфорорганические отравляющие вещества, ФОС — фосфорорганические соединения, ВТТ — дитиотреитол, Н8Д — сывороточный альбумин человека, КРД — я-нитро-фенилацетат.
#Автор для связи (тел. 8 (921) 905-89-10; эл. почта: ngoncharov@gmail.com).
Для начала общие сведения. Альбумин синтезируется в печени со скоростью примерно 0.7 мг в час (т.е. 10—15 мг в день), период полураспада сывороточного альбумина человека (HSA) составляет 19—20 сут [5]. Молекула альбумина образована одной полипептидной цепью, состоящей из 585 а. о., имеет 17 дисульфидных связей и один остаток цистеина со свободной SH-группой (Cys34). Три гомологичных домена (I, II, III), каждый состоящий из двух субдоменов (А, В), образуют трехмерную структуру альбумина, которая достаточно лабильна, так что при взаимодействии молекулы альбумина с разными веществами имеют место такие эффекты, как кооператив-ность и аллостерическая модуляция, обычно присущие мультимерным белкам [6, 7]. Молекула альбумина не покрыта углеводной оболочкой и может связывать самые разные молекулы и атомы: воду и катионы металлов (Са2+, Na+, K+), свободные жирные кислоты и жирорастворимые гормоны, неконъюгированный билирубин, соли желчных кислот, трансферрин, окись азота, аспирин, варфарин, фенилбутазон, клофибрат, фени-тоин и т.д. [8]. Связывая лекарства и токсические
вещества, альбумин в значительной степени определяет их фармако- и токсикокинетику, транспортируя к тканям-мишеням или местам их биотрансформации. Связывание происходит по двум первичным сайтам и нескольким вторичным, количество которых зависит от физико-химических свойств веществ и состояния молекулы альбумина. Так, для жирных кислот — основного лиганда альбумина — имеется 7 сайтов связывания, причем связавшиеся жирные кислоты изменяют полярность и объем сайтов связывания лекарственных препаратов [9].
Однако альбумин является не только пассивным, но и активным участником фармако- или токсикокинетических процессов. В первую очередь нас интересует взаимодействие альбумина с эфирами. В многочисленных экспериментах была показана эстеразная или псевдоэстеразная активность альбумина по отношению к а-нафтил-ацетату и я-нитрофенилацетату (МРЛ) [10—12], эфирам жирных кислот [13], аспирину [14], глюку-рониду кетопрофена [15], циклофосфамиду [16], эфирам никотиновой кислоты [17], октаноилгре-лину [18], нитроацетанилиду [19], нитротри-фторацетанилиду [20], фосфорорганическим пестицидам [21].
Ацетилирование — характерный пример псев-доэстеразной активности альбумина (реакция псевдопервого порядка), когда убыль эфирного субстрата обусловлена не его гидролизом, а образованием им ковалентных связей по многим аминокислотным остаткам (сайтам) молекулы альбумина. Установлено, что ацетилирование альбумина МРЛ может идти по 82 а.о. (сайтам), из них 59 а.о. лизина, 10 — серина, 8 — треонина, 4 — тирозина и 1 — аспартата [22]. МРЛ проявляет наибольшее сродство к Туг411, однако аддукты, аце-тилированные по остаткам лизина, более стабильны.
Необходимо отметить, что в токсикологии наибольший интерес представляет проблема (псевдо)эстеразной активности альбумина по отношению к фосфорорганическим соединениям (ФОС) — эфирам фосфорной кислоты, и особенно по отношению к высокотоксичным фосфор-органическим отравляющим веществам (ФОВ) — эфирам фосфоновой кислоты, к которым относятся зарин, зоман, У-газы. В последние годы удалось установить два сайта образования кова-лентных аддуктов ФОВ с альбумином — Туг411 и Туг150 [23, 24].
Помимо (псевдо)эстеразной активности, альбумин проявляет пероксидазную активность по отношению к гидроперекисям липидов [25—27] и
ряд других активностей, о которых пойдет речь во второй части данной статьи. Несмотря на очевидные успехи современных аналитических методов и стремление некоторых ученых доказать с помощью этих методов отсутствие у альбумина истинно эстеразной и других типов ферментативной активности, полученные результаты не позволяют однозначно решить проблему. До сих пор механизмы взаимодействия различных эфиров и других соединений с альбумином остаются нераскрытыми.
Целью настоящей работы является анализ данных, полученных на протяжении многих десятилетий, которые, наряду с результатами собственных исследований авторов, позволяют нам обосновать гипотезу о существовании у альбумина не только "псевдо", но также истинной ферментативной активности. Собраны сведения не только об эстеразной, но и других активностях альбумина, на основании чего предлагается рассмотреть его возможное место в номенклатуре ферментов.
1. ЭСТЕРАЗНАЯ И ПСЕВДОЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ АЛЬБУМИНА
Ферменты снижают энергию активации субстрата, как известно, двумя способами [28]: 1) снижая свободную энергию переходного состояния субстрата в результате его четкой пространственной фиксации, 2) изменяя путь реакции от субстрата к продукту, например, делая его многоступенчатым, с образованием ряда промежуточных продуктов. Мы исходим из того (и одновременно обосновываем это), что альбумину присущи оба способа снижения энергии активации реакции с субстратом. Но даже если бы альбумин осуществлял гидролиз эфиров исключительно вторым способом (изменение пути реакции), имеются все основания считать его ферментом. Механизм трехстадийной ферментативной реакции с образованием ковалентного ад-дукта в качестве промежуточного продукта реакции описан настолько давно, что уже прочно вошел в классические учебники по энзимологии (см., напр., [29]). Константа к2 становится константой образования ковалентного аддукта (напр., ацилфермента), вводится дополнительная кинетическая константа к3 (она же кса1), которая, как правило, характеризует лимитирующую стадию ферментативной реакции, а в случае ацилиро-вания описывает скорость собственно гидролиза, т.е. перехода ацильной группы с молекулы белка на молекулу воды (схемы 1—5) [23, 30—33].
Е + ХР вЕ • ХР-^ЕР + X Е + Р
к-1 +И20
Схема 1. Взаимодействие между эстеразой (Е) и фосфоэфиром ХР [30]. ИЯА + 02М-С6И4-0Ас ИЯА ■ О2К-С6И4-ОАсф^ ИЯА-ОАс + О2МС6И4ОИ ИЯА + АсОИ
К_1 К_2 к_з
Схема 2. Взаимодействие между альбумином (ИЯА) и МРА [31].
С6И5ОИ + АсОИ -К^С6И5ОАс + ША-^ С6И5ОАс • ИЯА С6И5ОИ + АсО-ИЯА-^ АсОИ + ША
Схема 3. Спонтанный и катализируемый альбумином гидролиз и-нитрофениловых эфиров на примере фенилацетата [32]. Здесь: Ко — константа спонтанного гидролиза, К — субстратная константа (константа диссоциации фермент-субстратного комплекса), Кса1 — каталитическая константа, К — константа деацилирования (константа диссоциации комплекса ацил-альбумин).
'-Ви О к ?_Би О к Г-Би О . '-Ви О
^-С^ ^ ША + у4-сц3-^ Н"СН3 + Р" ЬР-СН3 + И8А
НзС ОИ И3С р И3С А И3С Он
ША
Схема 4. Спонтанный и катализируемый альбумином гидролиз зомана (3,3-диметил бутан-2-ил метилфосфонофторид, C7Hl6FO2P) [23]. Здесь: Кь — константа спонтанного гидролиза, Кр — константа фосфонилирования зомана, Кг — константа реактивирования альбумина.
Е + 8 ^ЕЯ (а) ЕЯ ^ ЕА + Р (Ь)
ЕА + И2О —»-Е + ИА (с)
К1
Е + Я т-^ ЕЯ (d)
К-1
ЕЯ + И2О Е + Р + ИА (е)
Схема 5. Схемы взаимодействия между ацетилхолинэстеразой (Е) и ацетилхолином (Я), с указанием всех основных этапов (а—с) и упрощенная ^—е) [33], где Е — фермент (эстераза). Здесь: Кг — константа реактивирования альбумина.
Вид схемы и обозначения кинетических констант могут отличаться (схемы 3, 4), но суть от этого не меняется. Скорости ацилирования и деацилирования для разных субстратов варьируют в очень широких пределах, и было немало разговоров о той границе, начиная с которой можно говорить об "истинном" катализе (эстеразная активность), в отличие от псевдокатализа (псевдо-эстеразная активность). Граница так и не была установлена, как не был наведен порядок в номенклатуре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.