БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 4, с. 429 - 442
УДК 577.355.3
О МЕХАНИЗМАХ ФОТОПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОТОХЛОРОФИЛЛИДА В ХЛОРОФИЛЛИД
Обзор
© 2014 О.Б. Беляева*, Ф.Ф. Литвин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва 119991, факс: +7(495)939-4309, электронная почта: belyaeva0104@gmail.com
Поступила в редакцию 14.01.14
В обзоре представлены и обсуждаются данные, полученные при исследованиях механизмов первичных фотофизических и фотохимических реакций процесса восстановления протохлорофиллида в этиолированных листьях растений и модельных системах. Можно сделать заключение, что фотовосстановление активных форм протохлорофиллида представляет собой сложный многоступенчатый процесс, включающий образование двух или трех короткоживущих интермедиатов, характеризующихся синглетным сигналом ЭПР. Первый интермедиат, по-видимому, представляет собой комплекс с переносом заряда между протохлорофилли-дом и донором гидрид-иона НАДФН. Донором второго протона является консервативный тирозиновый остаток Туг-193 фотоэнзима ПОР.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хлорофилл, протохлорофиллид, фотовосстановление, нефлуоресцирующие интер-медиаты, спектры флуоресценции, спектры поглощения.
Заключительная светозависимая стадия биосинтеза хлорофилла в листьях растений включает фотовосстановление его непосредственного предшественника протохлорофиллида и целый ряд световых и темновых реакций, приводящих к формированию системы функциональных форм хлорофилла двух фотосистем фотосинтеза. Фотопревращение протохлорофиллида в хлорофиллид представляет собой присоединение двух атомов водорода в положениях С17 и С18 тетрапиррольной молекулы протохлорофиллида, при этом двойная связь заменяется одинарной (рис. 1). Высокая эффективность фотореакции в этиолированных листьях обусловлена тем, что она осуществляется внутри фотоактивного комплекса, возникающего в этиолированных листьях на предшествующей фотопревращению стадии темнового синтеза предшественника хлорофилла. Активный комплекс включает протохлорофиллид, донор водорода НАДФН и фотофермент протохлорофиллид оксидоредуктазу (ПОР) [1].
Принятые сокращения: ПОР — протохлорофиллид-оксидоредуктаза, Хл — хлорофилл, Пхл — протохлоро-филл, Пхлд — протохлорофиллид, Хлд — хлорофиллид.
* Адресат для корреспонденции.
Благодаря структуре активного тройного комплекса создаются благоприятные для реакции фотовосстановления пространственные отношения протохлорофиллида и доноров водорода. Реакция катализируется фотоферментом ПОР. И фотофермент, и протохлорофиллид этиопластов находятся в агрегированном, скорее всего, димерном состоянии.
В листьях растений, как этиолированных, так и зеленых, существует несколько спектрально различных форм протохлорофиллида [1]. Основными являются формы Пхлд633/628, Пхлд643/637 и обычно доминирующая форма Пхлд655/650 (цифрами показано положение максимумов флуоресценции и поглощения). Кроме того, обнаружено несколько минорных длинноволновых форм. Основной активной формой протохлорофиллида является Хлд655/650, благодаря превращению которой синтезируется основная масса хлорофилла.
С помощью низкотемпературной спектроскопии и спектроскопии высокого временного разрешения было обнаружено, что фотовосстановление протохлорофиллида представляет собой достаточно сложный процесс, включающий несколько быстрых световых и темновых реакций.
КОРОТКОЖИВУЩИЕ
ИНТЕРМЕДИАТЫ ФОТОПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОТОХЛОРОФИЛЛИДА В
ХЛОРОФИЛЛИД in vivo, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕСЯ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ
Нефлуоресцирующий интермедиат Х690. Исследование фотовосстановления протохлоро-филлида in vivo (в этиолированных листьях) при очень низких температурах, когда заторможены биохимические температурнозависимые стадии, позволило приблизиться к выяснению механизма этой реакции. Было обнаружено, что квантовый выход флуоресценции активной формы про-тохлорофиллида падает после освещения листьев при низкой температуре (77—173 К) без появления каких-либо новых полос флуоресценции. При последующем повышении температуры в темноте наблюдали появление полос флуоресценции, характерных для хлорофиллида. Было высказано предположение, что при низких температурах под действием возбуждающего света молекула протохлорофиллида переходит в промежуточное состояние (нефлуоресцирующий интермедиат), превращение которого в хлоро-филлид происходит в результате следующей темновой реакции, протекающей после повышения температуры [2—14]. Фотоиндуцирован-
ное тушение флуоресценции происходит даже при температуре жидкого гелия [12], что указывает на элементарный фотофизический характер первичной реакции.
Полоса поглощения нефлуоресцирующего интермедиата, стабилизирующегося при низких температурах, расположена около 690 нм [15]. Позднее близкое положение максимума поглощения первичного интермедиата было зафиксировано и при комнатной температуре [16, 17]. Обнаруженный интермедиат принято называть Х690. В темноте при повышении температуры интемедиат Х690 превращается в хлорофиллид:
Пхлд655/650 ^ Х690 ^ Хлд.
О существовании нескольких короткоживущих нефлуоресцирующих интермедиатов. Исследование первичных стадий фотовосстановления протохлорофиллида при очень низких температурах позволило прийти к заключению о существовании еще более ранних стадий фотохимической реакции, чем образование интермедиата Х690. Об этом свидетельствует сравнение картины спектральных изменений после освещения этиолированных листьев при разных температурах [9-11, 18-21] (рис. 2).
Первичная реакция, проявляющаяся в фото-индуцированном тушении флуоресценции ак-
а б
Рис. 1. Структурные формулы молекул протохлорофилла(ида) — а и хлорофилла(ида) — б. соответствует СН2-СН3 для моновинильной формы пигмента и СН=СН2 — для дивинильной формы. Я2 соответствует С20 Н39 для протохлорофилла и хлорофилла и атому водорода — для протохлорофиллида и хлорофиллида
тивной формы протохлорофиллида Пхлд655/650, наблюдаемая при низких температурах, обратима при повышении температуры. Степень обратимости зависит от температурных условий освещения (75—80% после освещения при 4,2 К; 30—50% после освещения при 77 К; 5—6% после освещения при 153 К). Квантовый выход фото-индуцированного тушения флуоресценции протохлорофиллида Пхлд655/650 при глубоком охлаждении этиолированных листьев очень низок (на три порядка ниже, чем квантовый выход его фотовосстановления при комнатной температуре) и слабо зависит от температуры в пределах от 4,2 до 180 К. Он практически не изменяется при повышении температуры освещаемого объекта от 4,2 до 77 К и слабо возрастает (в полтора раза) при 153 К (рис. 2). В большей степени от температуры освещения объекта зависит квантовый выход следующей реакции — образования первичных флуоресцирующих форм хлорофил-лида после повышения температуры освещенных образцов. Он (в отличие от квантового выхода тушения флуоресценции) существенно изменяется при повышении температуры освещаемых листьев от 4,2 до 153 К. Квантовый выход суммарной реакции (тушение флуоресценции
плюс последующее образование хлорофиллида после повышения температуры) в листьях, освещенных при 4,2 К, в три—четыре раза ниже, чем в листьях, освещенных при 77 К, и в десять раз ниже, чем в случае освещения при 153 К.
Приведенные факты свидетельствуют о большей сложности первичной реакции: о существовании на пути образования интермедиата Х690 обратных реакций, зависящих от температуры слабее, чем прямой процесс превращения нефлуоресцирующего интермедиата в хлоро-филлид.
С помощью флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии было установлено, что первичная фотореакция превращения протохлоро-филлида в нефлуоресцирующий интермедиат фотообратима под действием мощного монохроматического лазерного луча с длиной волны 694 нм (область поглощения интермедиата Х690) [22, 23]. Были рассчитаны константы скорости и квантовые выходы прямой и обратной фотореакций при фотостационарном равновесии. Расчеты показали, что причиной низкого квантового выхода процесса в целом не может служить фотообратимость реакции образования Х690, поскольку обратный процесс имеет зна-
X, нм
Рис. 2. Тушение флуоресценции как первичный акт фотовосстановления активной формы протохлорофиллида. Изменения низкотемпературных (77 К) спектров флуоресценции этиолированных листьев фасоли после освещения светом 104 Вт/м2 при низких температурах (4,2, 77, 153 К): 1 — неосвещенный этиолированный лист; 2 — тот же лист после освещения при низкой температуре (температура указана в верхней части рисунка); 3 — тот же образец после нагревания до 233 К (10 мин) в темноте; 4 — тот же образец после нагревания до 263 К (20 мин) в темноте
чительно (в 20 раз) более низкий квантовый выход. Так как образование Х690 необратимо в темноте, авторы предположили, что существует еще одно промежуточное звено, предшествующее образованию Х690 и включающее быструю обратную реакцию, которая и понижает выход процесса в целом. Предполагаемый интермеди-ат обозначили индексом R (reversible):
hv1
Пхлд655/650 ^ R ^ X690 ^ Хлд.
hv2
Полученные данные позволили объяснить падение квантового выхода реакции при низкой температуре по сравнению с квантовым выходом процесса при комнатной температуре, когда он близок к 0,5 [24—25]. При повышении температуры константы скорости прямых темно-вых процессов возрастают быстрее, чем константы обратных реакций, что и сопровождается увеличением общего выхода процесса образования хлорофиллида.
Анализ спектральных изменений (рис. 3) позволил предположить, что спектр поглощения первичного интермедиата Я, преимущественно образующегося при 77 К, близок (если не идентичен) к спектру поглощения активной формы протохлорофиллида: первичный эффект действия света на этиолированный лист, проявляющийся по тушению флуоресценции прото-хлорофиллида, наблюдается в тех условиях, когда Х690 практически не заметен по спектрам поглощения (при 80% тушении флуоресценции спектр поглощения практически не изменяется) [18, 19]. В спектрах поглощения листьев, освещенных при 153 К, наблюдается уменьшение полосы поглощения протохлорофиллида на 10—12% и появление длинноволнового макси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.